Target-adjacent motief (PAM): het slotje dat bepaalt waar CRISPR mag knippen
Stel je een sleutel voor die vrijwel elk slot ter wereld kan openen, maar alleen als er direct naast dat slot een klein extra kenmerk zit — een streepje, een kleurtje, een inkeping. Zonder dat kenmerk weigert de sleutel domweg te draaien, hoe goed de rest ook past. Zoiets is het target-adjacent motief, beter bekend onder de Engelse vakterm PAM (protospacer adjacent motif): een kort stukje DNA, meestal maar twee tot zes bouwstenen lang, dat direct naast de plek ligt waar het gen-knipgereedschap CRISPR-Cas9 moet aangrijpen.
Zonder deze korte 'markering' gebeurt er niets, ook al is de rest van de match perfect. Dat maakt de PAM tot een van de belangrijkste, maar minst bekende onderdelen van CRISPR: het is niet het onderdeel dat het DNA herkent of knipt, maar het onderdeel dat toestemming geeft om te beginnen. Voor wetenschappers die het menselijk genoom willen bewerken om ziektes te genezen, betekent dit dat ze niet zomaar overal kunnen knippen — alleen waar toevallig zo'n PAM-sequentie in de buurt ligt.
Wat is het precies?
Om te begrijpen wat een PAM doet, moet je eerst weten hoe CRISPR-Cas9 werkt. Cas9 is een eiwit — een soort moleculaire schaar — dat DNA kan doorknippen. Het eiwit weet niet uit zichzelf waar het moet knippen; daarvoor krijgt het een stukje RNA mee, het gRNA (guide-RNA, oftewel 'gids-RNA'), dat als een soort GPS-coördinaat fungeert. Dit gRNA is opgebouwd als een spiegelbeeld van de DNA-sequentie die je wilt bewerken, de zogeheten protospacer of doelsequentie.
Je zou verwachten dat Cas9 simpelweg het hele genoom afzoekt naar een DNA-stuk dat matcht met het gRNA. In de praktijk gaat het net andersom: het Cas9-eiwit scant het DNA eerst op zoek naar een PAM-sequentie. Alleen als het zo'n PAM tegenkomt, gaat het controleren of het daaraan grenzende DNA overeenkomt met het gRNA. Vindt het geen match, dan laat het los en zoekt verder naar de volgende PAM.
Bij de meest gebruikte variant, SpCas9 (afkomstig uit de bacterie Streptococcus pyogenes), bestaat de PAM uit de letters 'NGG'. De N staat voor 'elke willekeurige DNA-letter' en de GG voor twee keer de bouwsteen guanine op rij. Pas als Cas9 zo'n NGG-combinatie vindt, ontvouwt het de DNA-dubbele-helix ernaast en vergelijkt het de streng met het gRNA. Komt die overeen, dan klapt het eiwit in elkaar als een mes en knipt het beide DNA-strengen door.
Andere Cas-varianten hebben andere PAM-voorkeuren. Cas12a (ook wel Cpf1 genoemd) herkent bijvoorbeeld de sequentie 'TTTV'. Dat lijkt een detail, maar het bepaalt in de praktijk welk deel van het genoom met welk gereedschap bewerkbaar is.
Wat wil men ermee bereiken?
In de natuur is de PAM allereerst een veiligheidsmechanisme. CRISPR is oorspronkelijk het afweersysteem van bacteriën tegen virussen. Wanneer een bacterie een virus overleeft, knipt ze een stukje van het virale DNA uit en slaat dat op in haar eigen genoom, als een soort mugshot-archief. Bij een volgende aanval herkent de bacterie het virus aan dit opgeslagen fragment en stuurt ze Cas-eiwitten erop af om het virale DNA kapot te knippen.
Het probleem is dat de bacterie dat opgeslagen virale fragment ook in haar eigen genoom heeft zitten. Zonder extra controle zou het afweersysteem dus per ongeluk het eigen DNA kunnen aanvallen. De PAM lost dit op: het opgeslagen fragment in het bacteriële genoom mist de PAM ernaast, terwijl een binnendringend virus die PAM wél bij zich draagt. Zo kan de bacterie 'zelf' van 'vreemd' onderscheiden.
Mensen hebben dit natuurlijke systeem overgenomen als gereedschap om vrijwel elk gewenst gen te kunnen aanpassen — in cellen, planten of dieren. De belofte is groot: erfelijke ziektes genezen door een foutief gen te herstellen, gewassen resistenter maken tegen droogte of ziektes, en fundamenteel onderzoek doen naar wat genen precies doen door ze gericht uit te schakelen. Maar de PAM-vereiste betekent dat lang niet elke DNA-plek zomaar bewerkbaar is: alleen plekken met een geschikte PAM in de buurt komen in aanmerking, wat de precisie van gentherapie in de praktijk beperkt.
Voorbeelden uit de praktijk
De rol van de PAM werd rond 2005-2009 voor het eerst goed beschreven door de Spaanse microbioloog Francisco Mojica en collega's aan de Universiteit van Alicante. Mojica had CRISPR-sequenties al in de jaren negentig ontdekt in bacterieel DNA, maar het duurde tot deze latere publicaties voordat duidelijk werd dat het motief naast de doelsequentie de sleutel was tot het onderscheid tussen eigen en vreemd DNA — een inzicht dat de basis legde voor al het latere CRISPR-onderzoek.
In 2012 publiceerden Jennifer Doudna (University of California, Berkeley) en Emmanuelle Charpentier (destijds verbonden aan de Umeå Universiteit) het baanbrekende artikel waarin ze lieten zien dat Cas9 met een op maat gemaakt gRNA geprogrammeerd kon worden om vrijwel elke gewenste DNA-sequentie te knippen — mits er een passende PAM aanwezig was. Voor dit werk ontvingen zij in 2020 de Nobelprijs voor de Scheikunde.
Een jaar later, in 2013, toonde Feng Zhang van het Broad Institute (verbonden aan MIT en Harvard) aan dat CRISPR-Cas9 ook werkt in menselijke cellen, wat de weg opende naar medische toepassingen.
Om de PAM-beperking te omzeilen ontwikkelde het lab van David Liu (eveneens Broad Institute) in 2018 de varianten xCas9 en Cas9-NG, die met een veel ruimere set aan PAM-sequenties overweg kunnen dan het originele NGG. In 2020 volgde de variant SpRY uit hetzelfde lab, die nagenoeg PAM-loos werkt en daardoor bijna elke plek in het genoom toegankelijk maakt.
Het meest concrete resultaat tot nu toe is Casgevy (ook bekend als exa-cel), een CRISPR-gebaseerde gentherapie tegen sikkelcelziekte en bèta-thalassemie, ontwikkeld door Vertex Pharmaceuticals en CRISPR Therapeutics. De Amerikaanse geneesmiddelenautoriteit FDA keurde deze therapie in december 2023 goed — de eerste CRISPR-behandeling die de klinische praktijk haalde.
Hoe ver is de techniek?
CRISPR-Cas9, en daarmee de kennis over PAM-sequenties, is inmiddels volwassen labgereedschap: het wordt dagelijks gebruikt in duizenden onderzoekslaboratoria wereldwijd. De stap naar goedgekeurde medische behandelingen is echter pas net gezet, met Casgevy als enige voorbeeld tot dusver, en de behandeling kost tot nu toe zo'n twee miljoen dollar per patiënt — een prijs die toegankelijkheid ernstig beperkt.
Een belangrijk technisch obstakel blijft het risico op zogeheten off-target-effecten: het knippen op plekken die net iets lijken op de bedoelde doelsequentie, met onvoorspelbare gevolgen. De ontwikkeling van PAM-flexibelere Cas9-varianten zoals SpRY vergroot het aantal bewerkbare plekken, maar verhoogt tegelijk mogelijk het risico op dit soort ongewenste knipfouten, omdat de tool minder kieskeurig is geworden.
Ook het eigen afweersysteem van de patiënt vormt een obstakel: sommige mensen blijken al antilichamen tegen het Cas9-eiwit te hebben, vermoedelijk doordat Cas9 oorspronkelijk uit bacteriën komt waarmee mensen weleens in aanraking komen. Dit kan de werkzaamheid van een behandeling ondermijnen of een immuunreactie opwekken.
Daarnaast blijft er een stevig ethisch debat bestaan over kiembaanbewerking — het aanpassen van DNA in embryo's of geslachtscellen, waarbij veranderingen overerfbaar worden op toekomstige generaties. Vrijwel de hele wetenschappelijke gemeenschap hanteert hiervoor op dit moment een moratorium, na de spraakmakende en breed veroordeelde zaak van de Chinese onderzoeker He Jiankui, die in 2018 CRISPR-babies liet geboren worden.
Wie werken eraan?
De Verenigde Staten vormen het zwaartepunt van CRISPR-onderzoek, met instituten als het Broad Institute (MIT/Harvard) en het Innovative Genomics Institute van Jennifer Doudna aan UC Berkeley als belangrijkste kenniscentra. Bedrijven als Editas Medicine, Intellia Therapeutics, CRISPR Therapeutics en Vertex Pharmaceuticals vertalen de wetenschap naar klinische toepassingen.
In Europa speelde de Universiteit van Alicante in Spanje, met Francisco Mojica, een grondleggende rol bij het ontrafelen van het PAM-mechanisme. Ook in Nederland wordt actief CRISPR-onderzoek gedaan, onder meer bij Wageningen University & Research (gewasveredeling) en het Hubrecht Institute in Utrecht (fundamenteel celbiologisch onderzoek).
China is eveneens een grote speler, met omvangrijk onderzoek naar zowel landbouwtoepassingen als medische CRISPR-toepassingen, al ligt daar door de eerdere ethische controverse extra internationale aandacht op regelgeving en toezicht.