Single-nucleosome imaging: het DNA-pakketje onder de microscoop
Stel je het DNA in een van je cellen voor als een extreem lang stuk garen: zo'n twee meter, propgepropt in een celkern die maar enkele duizendsten van een millimeter groot is. Dat lukt alleen omdat het garen niet los ligt, maar in kleine kraaltjes is opgewonden. Elk kraaltje heet een nucleosoom: een klosje van acht eiwitten (histonen) waar een stukje DNA van ongeveer 147 bouwstenen omheen gewikkeld zit. Miljoenen van die kraaltjes achter elkaar vormen samen het chromatine, het verpakte DNA in de celkern.
Single-nucleosome imaging is een verzameling microscopietechnieken waarmee onderzoekers niet naar de hele streng kijken, maar naar losse, individuele kraaltjes: waar ze precies liggen, hoe dicht ze op elkaar zitten en hoe ze bewegen, zelfs in een levende cel. Dat is te vergelijken met het verschil tussen een foto van een volle concertzaal en het volgen van één specifieke bezoeker die door de zaal beweegt. Die individuele blik bleek nodig omdat het klassieke schoolplaatje van netjes opgerold DNA, als een strak gedraaide telefoonkabel, niet klopt met wat je ziet zodra je op het niveau van losse nucleosomen kijkt.
Wat is het precies?
Om één nucleosoom te kunnen zien, moet je twee problemen oplossen. Ten eerste is een nucleosoom met ongeveer 10 nanometer veel kleiner dan wat een gewone lichtmicroscoop kan onderscheiden (die houdt op rond de 200 nanometer, de zogeheten diffractielimiet). Ten tweede zitten er in een celkern miljoenen nucleosomen tegelijk, dus als je ze allemaal tegelijk zou kleuren, zie je alleen een egale gloed.
De oplossing zit in twee families van technieken. De eerste is super-resolutiemicroscopie, zoals STORM en PALM, waarbij fluorescente kleurstofjes willekeurig aan en uit knipperen. Op elk moment lichten er maar een paar op, ver genoeg uit elkaar om los te herkennen; door duizenden van die momentopnames te combineren, bouw je een beeld op met een scherpte tot enkele tientallen nanometers, ruim onder de klassieke lichtlimiet.
De tweede aanpak is single-particle tracking in levende cellen. Onderzoekers plakken daarbij een klein, chemisch te activeren fluorescent label (bijvoorbeeld op een systeem dat bekendstaat als HaloTag) aan een histoneiwit. Door maar een héél klein aandeel van alle labels tegelijk 'aan te zetten' met licht, zie je slechts een handjevol nucleosomen tegelijk oplichten. Een gevoelige camera volgt vervolgens, honderden keren per seconde, hoe die stipjes in een levende cel bewegen. Zo ontstaat een film van individueel nucleosoomgedrag in plaats van een statische foto.
Een derde, aanvullende route is elektronenmicroscopie in 3D, waarbij chromatine chemisch wordt gemarkeerd en vervolgens in dunne lagen wordt doorgescand om een driedimensionaal reliëf van de DNA-eiwitverpakking te reconstrueren, zonder dat je afhankelijk bent van fluorescente labels.
Wat wil men ermee bereiken?
De kern van de motivatie is simpel: hoe DNA in de kern ligt opgevouwen, bepaalt mede welke genen aan of uit staan. Een gen dat diep weggestopt zit tussen dicht opeengepakte nucleosomen is voor de celmachinerie moeilijker te bereiken dan een gen in een los, open stukje chromatine. Als je wilt begrijpen hoe cellen zich specialiseren tot bijvoorbeeld een spiercel of een zenuwcel, hoe veroudering het genoom beïnvloedt, of hoe in kankercellen de genregulatie ontspoort, dan moet je weten hoe die verpakking er in het klein uitziet en hoe dynamisch die is.
Voor het onderzoeksveld was er nog een tweede, meer fundamentele drijfveer: het decennialang gangbare schoolmodel ging ervan uit dat nucleosomen zich netjes opstapelen tot een regelmatige, dikke '30-nanometervezel'. Dat model was vooral gebaseerd op experimenten met opgezuiverd DNA in een reageerbuis, niet op waarnemingen in echte, levende cellen. Single-nucleosome imaging moest die aanname eindelijk in de praktijk toetsen.
Voorbeelden uit de praktijk
Het meest aangehaalde werk komt uit de groep van Kazuhiro Maeshima aan het National Institute of Genetics in Japan. Zijn team liet met super-resolutiemicroscopie en elektronenmicroscopie zien dat nucleosomen in levende cellen geen regelmatige vezel vormen, maar onregelmatige, wisselende klontjes die in de literatuur 'nucleosome clutches' zijn gaan heten, te vergelijken met losjes gestapelde knikkers in plaats van een stijve ketting.
In 2017 publiceerde de groep van Clodagh O'Shea aan het Salk Institute in de Verenigde Staten een invloedrijke studie in het tijdschrift Science, waarin een elektronenmicroscopietechniek (bekend als ChromEMT) voor het eerst een gedetailleerd driedimensionaal beeld gaf van hoe chromatine zich in de kern opvouwt, met wisselende dichtheid in plaats van een uniforme vezelstructuur.
Voor het volgen van losse nucleosomen in levende, delende cellen is veel gebruikgemaakt van chemische fluorescente kleurstoffen uit de zogenoemde Janelia Fluor-serie, ontwikkeld op het Janelia Research Campus van het Howard Hughes Medical Institute. Deze heldere, fotostabiele kleurstoffen maakten het mogelijk om nucleosomen minutenlang te volgen zonder dat het signaal te snel verbleekt, iets waar oudere fluorescente eiwitten vaak op vastliepen.
Ook is single-nucleosome tracking gebruikt om te onderzoeken hoe nucleosomen zich anders gedragen rond actief afgelezen genen dan in stille, 'opgeborgen' delen van het genoom: in actieve gebieden bewegen nucleosomen doorgaans net iets losser en beweeglijker, wat aansluit bij het idee dat lokale beweeglijkheid samenhangt met toegankelijkheid van DNA.
Hoe ver is de techniek?
Single-nucleosome imaging is een volwassen, maar nog altijd sterk in ontwikkeling zijnde onderzoekstechniek, geen kant-en-klaar instrument dat in elk laboratorium standaard op de plank ligt. Het vereist gespecialiseerde microscopen, geoefende operators en vaak maatwerk in celkweek en labeling, wat de techniek vooralsnog beperkt tot een relatief klein aantal gespecialiseerde laboratoria wereldwijd.
De belangrijkste vooruitgang van de afgelopen jaren zit in drie richtingen: snellere en gevoeligere camera's waarmee je nucleosomen met steeds hogere tijdsresolutie kunt volgen, betere en helderdere kleurstoffen die langer meegaan zonder te verbleken, en slimmere software om uit de ruwe, ruisige beeldenstroom betrouwbare bewegingsbanen van individuele stipjes te reconstrueren.
Belangrijke openstaande obstakels zijn onder meer: het risico dat een fluorescent label het gedrag van het gelabelde eiwit zelf verstoort, de moeite om diep in weefsel (in plaats van in platte celkweken) te kijken, en de uitdaging om niet alleen naar losse nucleosomen te kijken maar dat te combineren met informatie over welk specifiek gen er op dat moment actief is. Klinische toepassingen liggen nog ver weg; dit is voorlopig vooral fundamenteel, cel-biologisch onderzoek, geen diagnostisch of therapeutisch instrument.
Wie werken eraan?
Japan speelt een vooraanstaande rol, met name via het National Institute of Genetics, waar de groep van Kazuhiro Maeshima een groot deel van het baanbrekende werk aan nucleosoomdynamica in levende cellen heeft verricht, vaak in samenwerking met andere Japanse instituten zoals RIKEN.
In de Verenigde Staten zijn onder meer het Salk Institute for Biological Studies (elektronenmicroscopie van chromatine) en het Janelia Research Campus van het Howard Hughes Medical Institute (ontwikkeling van heldere, stabiele fluorescente kleurstoffen en beeldvormingsmethoden) belangrijke spelers. Daarnaast dragen tal van universitaire onderzoeksgroepen in de VS en Europa, verspreid over afdelingen celbiologie, biofysica en genetica, bij aan verfijningen van de techniek en aan de biologische interpretatie van de resultaten.
Het veld is relatief klein en sterk interdisciplinair: het brengt optische natuurkundigen (voor de microscopen zelf), scheikundigen (voor de fluorescente kleurstoffen) en moleculair bioloog en samen, wat samenwerking tussen instituten en landen tot een terugkerend kenmerk van dit onderzoek maakt.