Ratiometrische transcriptionele activatie: genen die naar verhoudingen luisteren
Stel je een bakrecept voor waarin niet staat "twee eetlepels suiker", maar "twee keer zoveel suiker als bloem". Verdubbel je de hele taart, dan verdubbelt de suiker vanzelf mee: de verhouding blijft precies gelijk, ongeacht de totale grootte van de taart. Iets vergelijkbaars gebeurt in sommige levende cellen en in genetisch aangepaste cellen die onderzoekers bouwen. In plaats van te reageren op de absolute hoeveelheid van één stof, reageert de cel op de verhouding tussen twee stoffen. Dat principe staat bekend als ratiometrische transcriptionele activatie.
Transcriptie is het proces waarbij de informatie in een gen wordt afgelezen en omgezet in een boodschapper-molecuul (RNA), de eerste stap op weg naar een eiwit. "Transcriptionele activatie" betekent dus simpelweg: een gen aanzetten. Bij een gewone schakelaar bepaalt de hoeveelheid van één signaalstof of het gen aan- of uitgaat. Bij een ratiometrisch systeem telt niet de absolute hoeveelheid van dat signaal, maar de verhouding tussen twee signalen. Een afweercel zou bijvoorbeeld pas een gen activeren als stof A twee keer zo veel aanwezig is als stof B, ongeacht of beide stoffen op dat moment veel of weinig voorkomen. Dat maakt het systeem ongevoelig voor ruis die alle signalen tegelijk laat stijgen of dalen, zoals verschillen in celgrootte of celgezondheid.
Wat is het precies?
Cellen zijn nooit helemaal identiek. De ene cel is groter dan de andere, heeft meer bouwstoffen (ribosomen, enzymen) of, in het laboratorium, meer kopieën van een ingebouwd stukje DNA. Die verschillen zorgen voor wat onderzoekers "ruis" noemen: twee genetisch identieke cellen kunnen toch een ander niveau van genactiviteit tonen. Er zijn grofweg twee soorten ruis. Intrinsieke ruis ontstaat door toeval in het aflezen van één specifiek gen. Extrinsieke ruis ontstaat doordat de hele cel, en dus alle genen tegelijk, wat drukker of rustiger is dan gemiddeld.
Een ratiometrische aanpak maakt hier slim gebruik van. Als twee signalen allebei worden beïnvloed door dezelfde extrinsieke ruis, dan valt die ruis grotendeels weg zodra je de verhouding tussen die twee signalen bekijkt in plaats van elk signaal apart. In de praktijk wordt dit principe op twee manieren toegepast. Ten eerste als meetmethode: onderzoekers bouwen twee verschillend gekleurde fluorescente eiwitten in een cel en meten de verhouding tussen beide kleuren, om zo specifieke genregulatie te onderscheiden van algemene celvariatie. Ten tweede als stuurmechanisme: een genetisch circuit wordt zo ontworpen dat het pas een doelgen activeert wanneer de verhouding tussen twee inputsignalen een bepaalde drempel overschrijdt.
Een verwant en goed onderbouwd concept is fold-change detection, oftewel verandering-detectie: de cel reageert op hóe sterk een signaal verandert ten opzichte van zijn beginwaarde, niet op het uiteindelijke absolute niveau. Dit kan worden uitgevoerd door een klein netwerkmotief dat een "incoherente feedforward-lus" heet: het ingangssignaal activeert daarbij zowel het uitvoergen als, via een omweg, een remmer van datzelfde uitvoergen. Met de juiste timing en sterkte zorgt dit ervoor dat het eindsignaal alleen afhangt van de relatieve verandering, niet van het totale niveau.
Wat wil men ermee bereiken?
Het belangrijkste doel is robuustheid. Cellulaire beslissingen, zoals delen, sterven of alarmeren, moeten betrouwbaar zijn, ook al variëren cellen onderling voortdurend in grootte, metabolisme en celcyclusfase. Ratiometrische regulatie is een manier waarop de natuur dit probleem al lang heeft opgelost, en die onderzoekers nu proberen te begrijpen en na te bouwen.
Daarnaast levert het betere metingen op. In synthetische biologie helpen ratiometrische reporters om experimentele ruis, zoals verschillen in plasmide-aantal of celgrootte tussen kweken, te scheiden van echte biologische signalen. Dat is cruciaal voor betrouwbare en onderling vergelijkbare onderzoeksresultaten.
Een derde drijfveer komt uit de celtherapie. Bij kanker verschillen ziek en gezond weefsel vaak niet in de simpele aan- of afwezigheid van een eiwit, maar in de hoeveelheid ervan of in de verhouding tussen twee eiwitten. Een gemodificeerde afweercel die reageert op zo'n verhouding, kan in theorie preciezer onderscheid maken tussen kwaadaardig en gezond weefsel, wat bijwerkingen zou kunnen verminderen. Ten slotte helpt het bestuderen van ratiometrische signaalverwerking om te verklaren waarom bepaalde ziekten ontstaan wanneer natuurlijke verhoudingen tussen signaalstoffen verstoord raken.
Voorbeelden uit de praktijk
- Fold-change detection in groeifactorsignalen — Lea Goentoro, Uri Alon en collega's (Weizmann Institute of Science) toonden in 2009 in het tijdschrift Molecular Cell aan dat cellen op signaalroutes zoals ERK en Wnt reageren op de relatieve verandering ten opzichte van het beginniveau, niet op de absolute eindconcentratie. Ze beschreven ook hoe een incoherente feedforward-lus deze verandering-detectie technisch mogelijk maakt.
- Ratiometrische ruismeting — Michael Elowitz en Peter Swain publiceerden in 2002 in Science een invloedrijke methode waarbij twee identieke maar verschillend gekleurde fluorescente eiwitten in dezelfde bacteriecel werden ingebouwd. Door de verhouding tussen beide kleuren te meten, konden zij voor het eerst onderscheid maken tussen ruis die één gen treft en ruis die de hele cel betreft, een techniek die sindsdien standaard is in onderzoek naar genexpressie.
- Ratiometrische standaarden in synthetische biologie — Onderzoekers rond Drew Endy (destijds MIT) beschreven in 2009 een methode om de activiteit van standaard-promotoren te meten ten opzichte van een vaste referentiepromotor. Deze ratiometrische maatstaf maakte metingen uit verschillende laboratoria vergelijkbaar en wordt nog steeds gebruikt binnen de jaarlijkse iGEM-competitie voor studenten synthetische biologie.
- Combinatorische antigeenherkenning in celtherapie — Kole Roybal, Wendell Lim en collega's (UCSF) publiceerden in 2016 in Cell een systeem van synthetische "synNotch"-receptoren waarmee afweercellen pas een gen activeren wanneer twee tumormerkers tegelijk aanwezig zijn. Vervolgwerk uit dezelfde onderzoekslijn verkent expliciet verhoudingsgevoelige varianten, om gezond weefsel te sparen dat toevallig één van de merkers draagt. Dit onderzoek ligt mede aan de basis van het biotechbedrijf Arsenal Biosciences, dat is opgericht om zulke "logic-gated" celtherapieën verder te ontwikkelen.
Hoe ver is de techniek?
Als meetmethode is ratiometrische techniek volwassen: ratiometrische reporters en gestandaardiseerde referentiepromotoren zijn al jaren gangbaar in laboratoria en in het onderwijs, bijvoorbeeld via iGEM. Als actief sturend circuit dat celgedrag verandert op basis van een precieze verhouding, staat het onderzoek nog vooral in de fundamentele fase. Het bouwen van betrouwbare "ratio-sensoren" is technisch lastig: biologische signalen zijn zelf ruisig, drempelwaarden moeten fijn worden afgesteld, en de timing waarop twee signalen worden vergeleken is bepalend voor een correct antwoord.
In celtherapie is de aanverwante technologie van Booleaanse logica-poorten, waarbij een cel reageert op de combinatie van twee merkers volgens een simpele aan/uit-regel, verder gevorderd en wordt getest in vroege klinische studies. Echt ratiometrische varianten, die reageren op een glijdende verhouding in plaats van een simpele ja/nee-combinatie, zijn nog experimenteler en vooral te vinden in preklinisch onderzoek met celkweken en diermodellen. Een belangrijke horde is dat nog onvoldoende duidelijk is hoe goed dergelijke circuits standhouden in de complexe, sterk fluctuerende omgeving van een levend lichaam, in tegenstelling tot de gecontroleerde omstandigheden van een petrischaaltje.
Wie werken eraan?
Aan de theoretische basis werkt het lab van Uri Alon aan het Weizmann Institute of Science in Israël, grondlegger van de fold-change-detectietheorie binnen de systeembiologie. In de Verenigde Staten onderzoekt het lab van Michael Elowitz aan Caltech ruis en ratiometrische meting in genetische circuits. Aan het MIT en binnen de bredere internationale iGEM-gemeenschap zijn ratiometrische meetstandaarden voor promotoractiviteit ontwikkeld en verspreid.
Op het gebied van celtherapie werkt het lab van Wendell Lim aan de University of California, San Francisco (UCSF) en het daaraan verbonden Cell Design Institute aan synNotch-receptorcircuits. Vanuit dat onderzoek zijn de biotechbedrijven Arsenal Biosciences en Sonoma Biotherapeutics voortgekomen, die logic-gated en verhoudingsgevoelige celontwerpen vertalen naar therapieën tegen kanker en auto-immuunziekten. Daarnaast dragen synthetische-biologielabs wereldwijd, onder meer in Europa en Azië en vaak verbonden via het iGEM-netwerk, bij aan het verder verfijnen en toepassen van ratiometrische meet- en regelmethoden.