Perturbatieproteomics: eiwitten begrijpen door het systeem expres te verstoren
Stel je voor dat je wilt weten waar elke knop op een ingewikkeld bedieningspaneel voor dient, maar er zit geen handleiding bij. Een logische aanpak: je drukt om de beurt op elke knop en kijkt wat er verandert. Dat is in de kern wat perturbatieproteomics doet, maar dan met levende cellen. Onderzoekers verstoren ("perturberen") een cel doelbewust — door een gen uit te schakelen, een medicijn toe te dienen of de cel te stressen — en meten vervolgens welke eiwitten daardoor veranderen.
Het woord klinkt technisch, maar de gedachte erachter is simpel. Proteomics is de grootschalige studie van eiwitten: de moleculen die vrijwel al het werk in een cel doen, van energieproductie tot celdeling. Perturbatie betekent verstoring. Door systematisch honderden of duizenden verschillende verstoringen uit te voeren en telkens te meten welke eiwitten stijgen, dalen of van vorm veranderen, ontstaat een soort schakelschema van de cel: welk onderdeel is met welk ander onderdeel verbonden, en wat gebeurt er als je ergens aan trekt.
Wat is het precies?
Een perturbatieproteomics-experiment volgt meestal een vast stramien. Eerst kiest een onderzoeksteam een manier om de cel te verstoren. Populaire methoden zijn CRISPR (een gentechniek waarmee je een specifiek gen heel precies kunt uitschakelen of afremmen), het toedienen van een geneesmiddel of testkandidaat-molecuul, of fysieke stress zoals hitte, zuurstoftekort of straling.
Vervolgens wordt, per verstoring, het proteoom gemeten: de volledige verzameling eiwitten die op dat moment in de cel aanwezig is, inclusief hoeveelheden en soms ook chemische aanpassingen daarvan. Dit gebeurt bijna altijd met massaspectrometrie, een techniek die eiwitten eerst in kleine stukjes knipt en daarna hun massa met hoge precisie meet om te bepalen welke eiwitten aanwezig zijn en in welke hoeveelheid.
Omdat je dit proces honderden of duizenden keren herhaalt — telkens met een andere verstoring — ontstaat een grote datamatrix: rijen van verstoringen tegenover kolommen van eiwitten. Met statistiek en machine learning zoeken onderzoekers vervolgens naar patronen: welke eiwitten reageren steeds samen (en horen dus waarschijnlijk bij dezelfde route in de cel), en welke verstoring lijkt op welke andere verstoring (en werkt dus mogelijk via hetzelfde mechanisme).
Een verwante en veelgebruikte variant is thermal proteome profiling: in plaats van een gen uit te schakelen, verwarm je cellen geleidelijk en meet je bij welke temperatuur elk eiwit stukvalt (denatureert). Bindt een medicijn aan een eiwit, dan verandert vaak die temperatuur. Zo kun je met warmte als "verstoring" opsporen aan welke eiwitten een stof zich precies vastklampt.
Wat wil men ermee bereiken?
Het menselijk lichaam maakt naar schatting tienduizenden verschillende eiwitten aan, en die werken zelden alleen: ze vormen netwerken en signaalroutes. Van veel eiwitten weten we welke bouwsteen (welk gen) ervoor codeert, maar niet precies wat ze doen of met wie ze samenwerken. Perturbatieproteomics probeert die functionele kaart in te vullen door oorzaak en gevolg direct te meten, in plaats van alleen te observeren welke eiwitten toevallig samen voorkomen.
Een belangrijk toepassingsgebied is medicijnontwikkeling. Voordat een kandidaat-geneesmiddel bij mensen getest mag worden, wil men weten aan welk eiwit het zich bindt (het "target"), en of het ook ongewenst aan andere eiwitten bindt ("off-target"-effecten, die bijwerkingen kunnen veroorzaken). Perturbatieproteomics kan dat in cellen in het laboratorium blootleggen, nog voordat er dierproeven of klinische studies nodig zijn.
Daarnaast hoopt men ziekteprocessen beter te begrijpen: als je een gen dat bij kanker betrokken is uitschakelt en ziet welke eiwitnetwerken daardoor verschuiven, leer je iets over hoe die kanker zich gedraagt en welke aangrijpingspunten er voor behandeling zijn. Het uiteindelijke, nog verre doel dat sommige onderzoekers voor ogen hebben, is een soort "atlas" of digitale simulatie van de cel waarin je virtueel elke knop kunt indrukken voordat je het in het echt in een laboratorium doet.
Voorbeelden uit de praktijk
Een paar concrete lijnen van onderzoek illustreren waar het veld vandaan komt en naartoe beweegt.
Cellular Thermal Shift Assay (CETSA) en Thermal Proteome Profiling: onderzoekers rond Daniel Martinez Molina beschreven in 2013 in Science de CETSA-methode om medicijnbinding via temperatuurverschuiving te meten. Het team van Mikhail Savitski en Marcus Bantscheff (destijds verbonden aan het bedrijf Cellzome en later EMBL Heidelberg) breidde dit rond 2014 uit tot proteoombrede metingen, waarmee in één experiment duizenden eiwitten tegelijk op medicijnbinding gescreend konden worden.
Perturb-seq: in 2016 publiceerden twee onderzoeksgroepen (Dixit en collega's, en onafhankelijk Adamson en collega's, beide in Cell) een methode om CRISPR-verstoringen te combineren met het aflezen van individuele cellen op grote schaal. Dit was oorspronkelijk vooral gericht op RNA in plaats van eiwitten, maar legde de basis voor latere technieken die ook eiwitniveaus in dezelfde verstoorde cellen proberen mee te meten.
Deep Visual Proteomics: de groep van Matthias Mann (Max Planck Institute of Biochemistry en Universiteit van Kopenhagen) publiceerde begin jaren 2020 methoden die microscopiebeelden combineren met massaspectrometrie op het niveau van individuele cellen, waardoor perturbatie-effecten ruimtelijk in weefsel zichtbaar worden in plaats van alleen in een reageerbuis vol cellen.
Cancer Dependency Map (DepMap): het Broad Institute voert op grote schaal CRISPR-verstoringsscreens uit op honderden kankercellijnen om te ontdekken van welke genen elke kankersoort "afhankelijk" is. Dit is strikt genomen vaker genomics dan proteomics, maar wordt in toenemende mate gecombineerd met proteoommetingen van dezelfde cellijnen om resultaten te bevestigen op eiwitniveau.
Het is eerlijk om te vermelden dat "perturbatieproteomics" zelf geen strak afgebakende, gestandaardiseerde term is met één duidelijke oprichtingsdatum; het is eerder een parapluterm die verschillende, langer bestaande technieken (thermal profiling, CRISPR-screens, chemische proteomics) onder één noemer samenbrengt naarmate deze velden meer met elkaar gaan samensmelten.
Hoe ver is de techniek?
De onderliggende bouwstenen — massaspectrometrie en CRISPR — zijn allebei volwassen, breed gebruikte laboratoriumtechnieken. Wat nog volop in ontwikkeling is, is de schaal en de snelheid waarmee je ze kunt combineren. Klassieke massaspectrometrie is relatief traag en heeft relatief veel cellen nodig per meting, wat het duur en tijdrovend maakt om duizenden verstoringen na elkaar te testen.
De afgelopen jaren is daar duidelijk vooruitgang in geboekt: nieuwere massaspectrometers en slimmere meetstrategieën (zoals "data-independent acquisition") maken metingen sneller en gevoeliger, en er wordt hard gewerkt aan proteomics op het niveau van losse cellen in plaats van miljoenen cellen tegelijk. Toch loopt perturbatieproteomics qua doorvoersnelheid nog altijd achter op vergelijkbare verstoringsexperimenten met RNA (zoals Perturb-seq), simpelweg omdat RNA makkelijker en goedkoper op grote schaal af te lezen is dan eiwit.
Een ander obstakel is data-analyse: met duizenden verstoringen en duizenden eiwitten ontstaan enorme, complexe datasets waarin oorzakelijke signalen lastig te scheiden zijn van ruis en indirecte effecten. Machine learning wordt steeds vaker ingezet om hierin patronen te vinden, maar de betrouwbaarheid en interpreteerbaarheid van zulke modellen staat nog ter discussie binnen het vakgebied. Kortom: de techniek werkt aantoonbaar en levert bruikbare resultaten op in specifieke toepassingen (vooral medicijnonderzoek), maar een volledige, betaalbare "cel-simulatie op knop-niveau" is nog toekomstmuziek.
Wie werken eraan?
Academisch loopt onderzoek onder meer via het Max Planck Institute of Biochemistry en de Universiteit van Kopenhagen (groep Matthias Mann, een van de meest invloedrijke ontwikkelaars van massaspectrometrie-technologie), EMBL Heidelberg (onder meer het werk van Mikhail Savitski op thermal proteomics), en het Broad Institute in de Verenigde Staten, waar grootschalige CRISPR- en proteomics-platforms worden gecombineerd.
In de private sector investeren farmaceutische bedrijven zoals Genentech, Novartis en Pfizer in interne perturbatieproteomics-platforms voor target-identificatie, vaak in samenwerking met academische groepen. Gespecialiseerde technologiebedrijven zoals Seer Inc. (nanodeeltjestechnologie voor proteoommetingen) en Bruker en Thermo Fisher Scientific (fabrikanten van massaspectrometers) leveren de instrumenten die dit soort onderzoek mogelijk maken. Ook biotechbedrijven die zich richten op grootschalige "perturbational biology" met beeldvorming en multi-omics, zoals Recursion Pharmaceuticals, bewegen zich in aangrenzend terrein.
Geografisch is er dus een duidelijke concentratie in de Verenigde Staten (Boston/Cambridge-regio rond het Broad Institute en MIT/Harvard) en Europa (Duitsland en Denemarken rond Mann en Savitski, en het Verenigd Koninkrijk met instituten als het Sanger Institute), met financiering die vaak komt van nationale onderzoeksbudgetten, de Europese Unie en particuliere biomedische stichtingen.