Perturb-seq: elk gen uitschakelen en meteen zien wat er in de cel verandert
Stel je voor dat je wilt weten wat elk van de duizenden onderdelen in een auto doet. De ouderwetse manier is: verwijder één bout, rij een rondje, en noteer of de auto nog start. Dat moet je dan voor elk onderdeel apart herhalen, en de enige uitkomst die je meet is "start hij nog wel of niet". Perturb-seq is de biologische versie van een veel slimmere aanpak: je haalt in duizenden auto's elk een ander onderdeel weg, en van elke auto maak je vervolgens een volledige diagnostische scan van alle systemen tegelijk — motor, elektronica, remmen, alles. Zo zie je niet alleen of de auto start, maar precies welke systemen door welk onderdeel worden beïnvloed.
In de praktijk betekent dit dat onderzoekers met Perturb-seq in één experiment duizenden individuele cellen elk een ander gen laten uitschakelen (of juist extra actief laten worden), en van elke cel apart aflezen welke van de zo'n twintigduizend genen in het menselijk genoom daardoor aan- of uitgaan. Dat levert in één klap een schat aan informatie op over wat een gen eigenlijk doet in de cel — iets waar klassieke genetica vroeger jaren experimenten voor nodig had. De naam is een samentrekking van "perturbation" (verstoring) en "sequencing" (sequencing, het aflezen van DNA of RNA).
Wat is het precies?
Perturb-seq combineert twee technieken die apart al bekend waren, maar die pas sinds 2016 op grote schaal aan elkaar zijn gekoppeld.
De eerste techniek is CRISPR, het "moleculaire schaartje" waarmee onderzoekers gericht in DNA kunnen knippen. Met CRISPR-Cas9 kun je een specifiek gen laten uitschakelen (knock-out). Er bestaan ook mildere varianten: CRISPRi (CRISPR-interference) gebruikt een uitgeschakelde versie van het Cas9-eiwit die niet knipt maar wel de aflezing van een gen blokkeert, zodat het gen minder actief wordt zonder dat het DNA zelf beschadigd raakt. CRISPRa doet het omgekeerde: het maakt een gen juist extra actief. Welk gen precies het doelwit is, wordt bepaald door een kort stukje RNA, de "guide RNA" of gids-RNA, dat als een soort adressticker naar de juiste plek in het DNA leidt.
De tweede techniek is single-cell RNA-sequencing, ofwel scRNA-seq. Hiermee kun je van duizenden individuele cellen apart aflezen welke genen op dat moment actief zijn — het zogeheten transcriptoom, de volledige verzameling boodschapper-RNA (mRNA) die een cel op dat moment aanmaakt. Dit gebeurt meestal met apparatuur die elke cel in een piepklein druppeltje isoleert, zodat het RNA van elke cel gescheiden blijft van dat van de buurcel.
Het slimme van Perturb-seq zit in de koppeling tussen die twee stappen. Een grote verzameling ("bibliotheek") van gids-RNA's, elk gericht op een ander gen, wordt via een virus in een grote groep cellen gebracht, zodanig dat elke cel meestal precies één gids-RNA binnenkrijgt en dus precies één genetische verstoring ondergaat. Om achteraf te kunnen zien welke cel welke verstoring kreeg, is het gids-RNA zelf ontworpen zodat het als een soort barcode wordt meegelezen tijdens de scRNA-seq-stap — een aanpak die bekend werd onder de naam CROP-seq. Na de sequencing heb je dus van elke cel twee dingen: welk gen is uitgeschakeld of geactiveerd, én het volledige genexpressieprofiel van die cel. Door cellen met dezelfde verstoring te groeperen en te vergelijken met controlecellen (die een gids-RNA kregen dat nergens op aangrijpt), kunnen onderzoekers berekenen welke genen door welke verstoring worden beïnvloed.
Wat wil men ermee bereiken?
Het uiteindelijke doel is een functionele kaart van het genoom: voor zoveel mogelijk van de circa twintigduizend menselijke genen willen onderzoekers weten wat er gebeurt als dat gen wegvalt of extra actief wordt. Klassieke genetica meet meestal één simpel kenmerk per experiment, zoals of een cel overleeft of van vorm verandert. Perturb-seq vervangt die ene meting door duizenden metingen tegelijk (de activiteit van alle andere genen), waardoor je niet alleen ziet dát er een effect is, maar ook via welke route dat effect loopt.
Dat is nuttig om drie redenen. Ten eerste helpt het om genregulatienetwerken te ontrafelen: welke genen sturen welke andere genen aan, en welke genen werken samen in dezelfde biologische route. Ten tweede kunnen onderzoekers combinaties van twee verstoringen tegelijk testen om genetische interacties (epistase) te ontdekken — situaties waarin het effect van gen A afhangt van of gen B ook is uitgeschakeld. Ten derde is de methode aantrekkelijk voor geneesmiddelenonderzoek: door ziekte-geassocieerde genen te verstoren in relevante celtypen, kan een farmaceutisch bedrijf zien welke downstream-effecten dat heeft, en zo potentiële medicijndoelwitten beter beoordelen vóórdat er een echt medicijn wordt ontwikkeld.
Een meer ambitieus, nog niet gerealiseerd doel is het trainen van rekenmodellen op grote Perturb-seq-datasets, zodat die modellen uiteindelijk kunnen voorspellen wat een nog niet uitgevoerde verstoring zou doen, zonder dat het natte labwerk nodig is. Dit wordt in onderzoekskringen wel aangeduid met de term "virtuele cel", al is dat vooralsnog een onderzoeksrichting en geen werkend product.
Voorbeelden uit de praktijk
De methode werd in 2016 vrijwel gelijktijdig door twee Amerikaanse onderzoeksgroepen gepubliceerd. Atray Dixit en collega's, verbonden aan het Broad Institute (in de groep van Aviv Regev), pasten de techniek toe op afweercellen om te bestuderen hoe transcriptiefactoren de immuunrespons sturen. In hetzelfde jaar publiceerde de groep van Jonathan Weissman aan de University of California, San Francisco (UCSF) een vergelijkbare studie (Adamson et al.), waarin ze de zogeheten "unfolded protein response" bestudeerden, een stresssysteem dat cellen gebruikt wanneer eiwitten verkeerd gevouwen raken.
In 2017 verbeterde de groep van Christoph Bock aan het CeMM-onderzoeksinstituut in Wenen de techniek met een methode genaamd CROP-seq, die het technisch eenvoudiger maakte om het gids-RNA betrouwbaar mee te lezen in de scRNA-seq-uitlezing. Zij pasten dit onder meer toe op T-cellen, een celtype uit het afweersysteem, om signaalroutes rond de T-celreceptor te ontrafelen.
Een belangrijke opschaling kwam in 2022, toen de groep van Jonathan Weissman (inmiddels ook verbonden aan het Whitehead Institute/MIT) een genoombreed Perturb-seq-experiment publiceerde in het tijdschrift Cell (Replogle et al.). Daarin werd met CRISPRi vrijwel elk gen dat tot expressie komt in twee menselijke cellijnen (K562-leukemiecellen en RPE1-cellen) stuk voor stuk afgeremd, verspreid over miljoenen individuele cellen — op dat moment de grootste dataset van dit type.
Sindsdien wordt de aanpak ook gecombineerd met machinaal leren: onderzoeksgroepen (onder meer aan Stanford University) hebben modellen als GEARS gebouwd die op basis van bestaande Perturb-seq-data proberen te voorspellen wat het effect zou zijn van een combinatie van genen die nog nooit experimenteel is getest. Ook het Arc Institute in Palo Alto bouwt aan grootschalige Perturb-seq-atlassen als bouwsteen voor dit soort voorspellende modellen.
Hoe ver is de techniek?
Perturb-seq heeft zich in relatief korte tijd ontwikkeld: van kleinschalige experimenten met enkele tientallen tot honderden genen in 2016, naar genoombrede screenings met bijna alle actieve genen in 2022. De methode wordt inmiddels op vrij brede schaal gebruikt in academische en industriële laboratoria voor functioneel-genomisch onderzoek.
Toch zijn er duidelijke beperkingen. De meeste experimenten vinden plaats in gekweekte cellijnen (zoals K562 of RPE1) of in stamcel-afgeleide celtypen, omdat die zich makkelijk laten kweken en genetisch aanpassen. Toepassing in levend weefsel (in vivo, bijvoorbeeld in muizen) of in primaire menselijke cellen die rechtstreeks uit patiënten komen, is technisch lastiger, vooral omdat het inbrengen van de gids-RNA-bibliotheek in zulke cellen minder efficiënt en minder gecontroleerd verloopt dan in een kweekschaaltje.
Een andere beperkende factor is kosten: sequencing van miljoenen individuele cellen is duur, en de hoeveelheid RNA per cel is klein, wat leidt tot technische ruis (veel genen worden toevallig niet gedetecteerd in een gegeven cel, ook al zijn ze wel actief — het zogeheten dropout-probleem). Ook is het uitzoeken van directe (causale) effecten versus indirecte gevolgen binnen een netwerk van duizenden genen statistisch complex.
De combinatie met machine learning staat nog in een vroeg stadium: modellen als GEARS kunnen redelijke voorspellingen doen voor situaties die lijken op wat al gemeten is, maar zijn nog niet betrouwbaar genoeg om laboratoriumexperimenten te vervangen bij werkelijk nieuwe biologische vragen. Onderzoekers zijn het erover eens dat aanvullende, grotere en diversere datasets nodig zijn voordat dit soort "virtuele cel"-modellen op grote schaal bruikbaar worden.
Wie werken eraan?
De belangrijkste pioniers zitten aan Amerikaanse onderzoeksinstellingen. Jonathan Weissman, oorspronkelijk verbonden aan UCSF, werkt tegenwoordig vanuit het Whitehead Institute en MIT verder aan de techniek en de opschaling ervan. Aviv Regev leidde de andere founding-groep vanuit het Broad Institute in Cambridge (Massachusetts) en is inmiddels ook actief in de farmaceutische sector. In Europa is vooral het CeMM-onderzoeksinstituut in Wenen, Oostenrijk, met de groep van Christoph Bock een belangrijke bijdrager, met name via de CROP-seq-methode.
Op het gebied van apparatuur en commerciële platforms speelt het Amerikaanse bedrijf 10x Genomics een centrale rol: hun systemen voor druppelgebaseerde single-cell sequencing en "feature barcoding" worden in de meeste hedendaagse Perturb-seq-experimenten gebruikt. Het Arc Institute, een relatief nieuw non-profit onderzoeksinstituut in Palo Alto (Californië), investeert in grootschalige Perturb-seq-datasets en in modellen die daarop worden getraind. Ook farmaceutische bedrijven, waaronder Genentech, passen de techniek toe in hun zoektocht naar nieuwe medicijndoelwitten.
Daarnaast dragen grote genomica-centra zoals het Wellcome Sanger Institute in het Verenigd Koninkrijk bij aan verwante grootschalige functioneel-genomische screeningsprojecten, al ligt de zwaartepunt van Perturb-seq-onderzoek vooralsnog duidelijk in de Verenigde Staten.