Lattice light-sheet microscopie: levende cellen filmen zonder ze te beschadigen
Stel je voor dat je door een raam een donkere kamer wilt filmen, maar elke keer dat je het licht aandoet, verbrandt er een beetje van wat erin staat. Dat is ongeveer het probleem waar biologen decennialang tegenaan liepen als ze levende cellen onder de microscoop wilden volgen: het licht dat nodig is om iets te zien, beschadigt tegelijk het weefsel dat je bekijkt. Lattice light-sheet microscopie is een microscopietechniek die dit probleem grotendeels omzeilt door een extreem dun, egaal vlak van licht door het monster te schijnen, in plaats van het hele preparaat fel te beschijnen of er met een felle laserstip doorheen te scannen.
Het resultaat is dat onderzoekers levende cellen, embryo's en zelfs kleine organismen urenlang in drie dimensies kunnen filmen, met scherpte tot op het niveau van individuele eiwitten, zonder dat het licht zelf het proces verstoort dat ze willen bestuderen. Denk aan het verschil tussen een operatielamp die een hele kamer verlicht en een laserlijn die theaterrook in een dunne, scherpe schijf snijdt: alleen dat ene plakje licht op, de rest blijft in het donker en dus ongemoeid.
Wat is het precies?
Om lattice light-sheet microscopie te begrijpen, helpt het eerst te weten hoe gewone microscopen licht gebruiken. Bij een confocale microscoop scant een laserstraal punt voor punt door het hele volume van een cel, ook door de delen die je op dat moment niet bekijkt. Bij een gewone lichtmicroscoop wordt het hele preparaat in één keer verlicht. Beide methoden belasten het weefsel met veel meer licht dan strikt nodig is voor het beeld dat je uiteindelijk ziet. Dat teveel aan licht veroorzaakt twee problemen: fototoxiciteit (het licht beschadigt cellen chemisch, bijvoorbeeld doordat het reactieve zuurstofdeeltjes vormt) en fotobleking (de fluorescente kleurstoffen die onderzoekers gebruiken om structuren zichtbaar te maken, doven uit onder te veel licht).
Lichtvlakmicroscopie, ook wel selective plane illumination microscopy (SPIM) genoemd, loste een deel van dit probleem al op door het monster van opzij te beschijnen met een dun vlak licht, terwijl een camera van bovenaf of vanaf de zijkant loodrecht daarop het beeld opvangt. Zo wordt alleen de laag die je fotografeert belicht, en de rest van het preparaat blijft donker. Het probleem was dat de gebruikte lichtvlakken met klassieke lenzen nooit overal even dun zijn: aan de randen van het beeldveld worden ze dikker, wat de scherpte en de resolutie (het vermogen om kleine details te onderscheiden) beperkt.
Lattice light-sheet microscopie, ontwikkeld door natuurkundige Eric Betzig en collega's, lost dit op door het lichtvlak niet met één simpele laserbundel te maken, maar met een patroon van tientallen zogeheten Besselbundels. Een Besselbundel is een speciaal gevormde lichtstraal die, in tegenstelling tot een gewone laserstraal, nauwelijks uitwaaiert (niet diffracteert) over een relatief lange afstand. Door veel van deze bundels naast elkaar te rangschikken in een herhalend, roosterachtig patroon (het 'optisch rooster' of 'lattice' waar de naam vandaan komt) en dit patroon razendsnel heen en weer te bewegen, ontstaat een lichtvlak dat over het hele beeldveld even dun en egaal blijft, vaak niet dikker dan enkele honderden nanometers (een nanometer is een miljardste meter). Dat uniforme, ultradunne lichtvlak maakt het mogelijk om met veel minder lichtenergie een scherper en gedetailleerder beeld te krijgen dan met oudere lichtvlaktechnieken, en dat in drie dimensies tegelijk, omdat de microscoop het monster laagje voor laagje doorscant terwijl het nauwelijks beschadigd raakt.
Wat wil men ermee bereiken?
Het uiteindelijke doel is simpel te omschrijven, ook al is de techniek zelf complex: biologen willen levende processen zien zoals ze werkelijk gebeuren, in drie dimensies, over tijd, zonder dat het observeren zelf het proces verandert. Veel van wat we weten over cellen komt van dode, chemisch gefixeerde preparaten, of van cellen die zo zwaar belicht zijn dat ze eigenlijk al aan het afsterven waren tijdens de opname. Dat geeft een vertekend beeld van dynamische processen zoals celdeling, de manier waarop immuuncellen ziekteverwekkers opsporen, of hoe een embryo zich in de eerste uren na bevruchting ontwikkelt.
Lattice light-sheet microscopie belooft daarom drie dingen tegelijk: hoge resolutie (details zien tot op het niveau van individuele moleculen of celstructuren), hoge snelheid (snel genoeg om bewegingen die milliseconden duren vast te leggen) en een lage lichtdosis (zodat je uren tot dagen kunt filmen zonder het monster te doden). Die combinatie was voor 2014 vrijwel onmogelijk: elke verbetering op één van deze drie punten ging meestal ten koste van een van de andere twee. De techniek is dus geen doel op zich, maar een gereedschap om fundamentele vragen in de celbiologie en ontwikkelingsbiologie te beantwoorden die eerder onbeantwoordbaar waren omdat het observatie-instrument zelf de waarneming verstoorde.
Voorbeelden uit de praktijk
De techniek werd voor het eerst uitgebreid beschreven in een veelgeciteerde publicatie uit 2014 in het tijdschrift Science, van Eric Betzig en een groot team medewerkers op Janelia Research Campus. In dat artikel lieten ze onder meer zien hoe ze de vorming van het zogeheten immunologische synaps konden filmen, het contactpunt waarop een T-cel (een type afweercel) een andere cel test op infectie, met een detailniveau dat eerder niet haalbaar was zonder het proces te verstoren.
In diezelfde en latere studies is de methode gebruikt om celdeling in stamcellen te volgen, en om de vroege embryonale ontwikkeling te filmen van modelorganismen die veel in laboratoria worden gebruikt, zoals de rondworm Caenorhabditis elegans, de zebravis en de fruitvlieg Drosophila. Omdat deze embryo's relatief doorzichtig zijn, lenen ze zich goed voor lichtvlaktechnieken.
Rond 2018 publiceerde de groep van Betzig, inmiddels aan de University of California, Berkeley, een vervolgstudie waarin lattice light-sheet microscopie werd gecombineerd met adaptieve optiek: een systeem dat vervormingen in het licht, veroorzaakt door dieper gelegen weefsel, in real time corrigeert. Hiermee kon men voor het eerst ook iets dikkere en minder doorzichtige weefsels scherp in beeld brengen, zoals delen van muizenweefsel, in plaats van alleen dunne, transparante monsters.
Sinds de introductie van commerciële systemen, met name de Lattice Lightsheet 7 van Zeiss die rond 2019-2020 op de markt kwam, gebruiken onderzoeksgroepen wereldwijd de techniek voor uiteenlopend werk, van het volgen van kankercellen die door immuuncellen worden aangevallen tot het bestuderen van hoe organoïden (kleine, in het lab gekweekte orgaanachtige structuren) zich ontwikkelen.
Hoe ver is de techniek?
Lattice light-sheet microscopie is inmiddels gegroeid van een uniek, met de hand gebouwd instrument in één laboratorium tot een techniek die via commerciële apparatuur in tientallen onderzoeksinstituten wereldwijd beschikbaar is. Die overgang verliep niet snel: de eerste systemen waren extreem lastig te bouwen en te bedienen, en vereisten gespecialiseerde optische kennis die maar weinig laboratoria in huis hadden. Pas met de komst van kant-en-klare commerciële systemen, met name vanaf Zeiss in 2019-2020 en licentiesystemen van het bedrijf 3i, werd de techniek toegankelijker voor bredere groepen biologen.
Toch blijven er duidelijke obstakels. De apparatuur is prijzig, met systemen die al snel enkele honderdduizenden euro's kosten, waardoor ze vooral in goed gefinancierde onderzoekscentra en imaging-faciliteiten staan opgesteld. Daarnaast produceert de techniek enorme hoeveelheden data: een enkel experiment kan al snel meerdere terabytes aan beeldmateriaal opleveren, wat vraagt om zware computerinfrastructuur en gespecialiseerde software om de losse laagjes tot een 3D-film samen te voegen (een proces dat deconvolutie wordt genoemd) en om ruis eruit te filteren, tegenwoordig steeds vaker met behulp van machine learning.
Een andere beperking is dat de methode het best werkt bij relatief kleine, dunne of doorzichtige monsters. Dieper in ondoorzichtig volwassen weefsel kijken blijft moeilijk, ook al heeft de toevoeging van adaptieve optiek sinds 2018 wel verbetering gebracht. De verwachting binnen het veld is dat verdere combinaties met andere technieken, zoals expansiemicroscopie (waarbij weefsel fysiek wordt opgerekt voordat het wordt bekeken) en slimmere beeldverwerkingsalgoritmen, de bruikbaarheid de komende jaren verder zullen vergroten, maar een doorbraak naar goedkope, op grote schaal inzetbare apparatuur is op dit moment niet in zicht.
Wie werken eraan?
De techniek is oorspronkelijk ontwikkeld door natuurkundige Eric Betzig en zijn team op Janelia Research Campus, een onderzoeksinstituut van het Howard Hughes Medical Institute (HHMI) in Virginia, Verenigde Staten. Betzig ontving in 2014 ook de Nobelprijs voor de Scheikunde, samen met Stefan Hell en William Moerner, maar dat was voor ander werk op het gebied van superresolutiemicroscopie; de lattice light-sheet-publicatie verscheen in datzelfde jaar als een apart project. Betzig is later overgestapt naar de University of California, Berkeley, waar hij met een aanstelling bij HHMI zijn onderzoek naar beeldvormingstechnieken voortzet.
Janelia Research Campus blijft een belangrijk centrum voor de verdere ontwikkeling van lichtvlaktechnieken, onder meer op het gebied van adaptieve optiek. Op het commerciële vlak is Carl Zeiss Microscopy (Duitsland) de belangrijkste partij, met het Lattice Lightsheet 7-systeem, en biedt ook het Amerikaanse bedrijf 3i (Intelligent Imaging Innovations) systemen aan onder licentie. Daarnaast zijn er wereldwijd talrijke academische imaging-faciliteiten, onder meer in de Verenigde Staten, het Verenigd Koninkrijk en op het Europese vasteland, die lattice light-sheet-opstellingen beheren voor gebruik door celbiologen, ontwikkelingsbiologen en immunologen.