Langeread-sequencing: dna in lange stukken lezen
Stel je voor dat je een dik boek moet lezen, maar iemand heeft het eerst door een papierversnipperaar gehaald. Je krijgt duizenden kleine snippers tekst en moet die vervolgens weer in de juiste volgorde leggen. Dat is grofweg hoe de meeste dna-sequencing (het aflezen van de volgorde van dna-bouwstenen) tot voor kort werkte: het genetisch materiaal werd in piepkleine stukjes van een paar honderd letters geknipt, afgelezen, en met software weer aan elkaar gepuzzeld. Langeread-sequencing doet iets anders: het leest hele bladzijden in één keer, soms zelfs hele hoofdstukken, zonder dat het boek eerst versnipperd hoeft te worden.
Die aanpak lijkt een detail, maar heeft grote gevolgen. Dna bevat namelijk veel stukken tekst die zich herhalen, zoals een bladzijde vol met "abcabcabcabc". Heb je alleen kleine snippers van zo'n herhaling, dan is het bijna onmogelijk om te zien hoe vaak "abc" precies terugkeert of waar de snipper in het geheel past. Lange, ononderbroken lezingen van dna lossen dat probleem grotendeels op. Daardoor kunnen onderzoekers stukken van het menselijk genoom in kaart brengen die decennialang een witte vlek bleven, en kunnen artsen bepaalde erfelijke aandoeningen beter opsporen.
Wat is het precies?
Dna is een lange streng die is opgebouwd uit vier soorten bouwstenen, aangeduid met de letters A, C, G en T. Sequencing is het proces waarmee de volgorde van die letters wordt afgelezen. De meest gebruikte techniek van de afgelopen vijftien jaar, populair gemaakt door onder meer het bedrijf Illumina, werkt met 'korte lezingen' (short reads): het dna wordt geknipt in stukjes van ongeveer 100 tot 300 letters, die apart worden afgelezen en daarna met software weer worden samengevoegd tot een compleet beeld, als een legpuzzel.
Langeread-technologieën lezen veel grotere stukken in één keer: doorgaans tussen de 10.000 en 100.000 letters, en in sommige gevallen zelfs meer dan een miljoen. Twee technieken domineren op dit moment de markt.
De eerste is SMRT-sequencing (Single Molecule Real-Time sequencing) van het bedrijf Pacific Biosciences, beter bekend als PacBio. Een enzym dat dna kopieert (dna-polymerase) wordt vastgezet in een piepklein putje, kleiner dan de golflengte van licht, een zogeheten zero-mode waveguide. Terwijl het enzym een nieuwe dna-streng opbouwt, bouwt het telkens een bouwsteen in die oplicht in een eigen kleur. Een camera filmt dat proces in real time en leest zo letter voor letter af welke bouwsteen wordt ingebouwd. Omdat het dna-molecuul rond wordt gemaakt, kan het enzym er meerdere keren overheen lopen; door die herhaalde lezingen met elkaar te vergelijken (circular consensus sequencing) ontstaat een zogeheten HiFi-lezing met een zeer lage foutmarge.
De tweede techniek is nanopore-sequencing, vooral bekend geworden dankzij het Britse Oxford Nanopore Technologies. Hierbij wordt een enkele dna-streng door een microscopisch klein poriegaatje (nanopore) in een membraan getrokken. Over dat membraan staat een kleine elektrische spanning. Elke letter die door de porie glijdt, verstoort de stroom op een net iets andere manier. Door die stroomveranderingen te meten en met algoritmes te vertalen, wordt de dna-volgorde direct afgelezen, terwijl het molecuul nog door de porie beweegt.
Beide technieken hebben gemeen dat ze geen versnippering en heropbouw nodig hebben: het lange, originele dna-molecuul wordt in één ononderbroken beweging afgelezen.
Wat wil men ermee bereiken?
Het belangrijkste doel is een vollediger en betrouwbaarder beeld van het genoom te krijgen. Met alleen korte lezingen bleven bepaalde gebieden van het menselijk dna altijd gissen, vooral de sterk repetitieve delen rond het centromeer (het middendeel van een chromosoom) en de telomeren (de uiteinden van chromosomen). Die gebieden bevatten soms duizenden herhalingen van vrijwel identieke stukjes tekst, waar korte snippers simpelweg niet eenduidig in te passen zijn.
Daarnaast helpt langeread-sequencing bij het opsporen van zogeheten structurele varianten: grote stukken dna die zijn verdwenen, verdubbeld, omgedraaid of verplaatst. Dit soort veranderingen kan honderden tot duizenden letters beslaan en wordt door korte lezingen vaak gemist, terwijl ze een rol kunnen spelen bij erfelijke ziekten en bij kanker.
Een derde doel is het direct aflezen van chemische 'stickers' op het dna, zoals methylgroepen, die de activiteit van genen beïnvloeden (epigenetica). Bij klassieke sequencing is daarvoor een aparte, agressieve chemische behandeling nodig (bisulfietbehandeling). Nanopore-sequencing kan die stickers in veel gevallen direct meten, zonder extra bewerking, omdat een gemethyleerde letter de elektrische stroom net iets anders beïnvloedt dan een normale letter.
Tot slot is er de belofte van draagbare en snelle sequencing. Het kleinste nanopore-apparaat past in een broekzak en kan resultaten binnen enkele uren opleveren, wat waardevol is bij uitbraken van infectieziekten of in afgelegen laboratoria zonder grote apparatuur.
Voorbeelden uit de praktijk
Een van de meest aansprekende resultaten is het werk van het Telomere-to-Telomere (T2T) Consortium, een internationale samenwerking die in 2022 in het tijdschrift Science de eerste werkelijk complete sequentie van een menselijk genoom publiceerde. Met een combinatie van PacBio HiFi- en nanopore-lezingen werd het laatste deel van het genoom opgehelderd dat sinds het Human Genome Project (grotendeels afgerond begin jaren 2000) onvolledig was gebleven, waaronder de complexe centromeergebieden.
Voortbouwend op dat werk publiceerde het Human Pangenome Reference Consortium in 2023 in Nature een eerste concept van een menselijk pangenoom: een referentiegenoom opgebouwd uit de dna-sequenties van tientallen mensen met uiteenlopende voorouders, in plaats van het ene, weinig diverse referentiegenoom dat decennialang de standaard was.
Tijdens de ebola-uitbraak in West-Afrika (2014-2015) namen onderzoeksteams draagbare nanopore-apparaten (MinION) mee naar lokale veldlaboratoria, zodat virusmonsters ter plekke gesequenced konden worden in plaats van naar een laboratorium elders te moeten worden verstuurd. Diezelfde MinION-technologie werd in 2016 door NASA-astronaut Kate Rubins gebruikt om voor het eerst dna te sequencen aan boord van het internationale ruimtestation ISS.
Tijdens de coronapandemie zetten gezondheidsinstellingen wereldwijd, waaronder ook Nederlandse laboratoria, nanopore-sequencing in om snel virusvarianten van SARS-CoV-2 te herkennen en te volgen, dankzij de combinatie van snelheid en draagbaarheid van de apparatuur.
Hoe ver is de techniek?
Langeread-sequencing bestaat al meer dan tien jaar, maar kampte lange tijd met een belangrijk nadeel: een hoger foutenpercentage dan korte-lezingtechnieken. Vroege nanopore-lezingen hadden foutmarges van rond de tien tot vijftien procent, wat de betrouwbaarheid voor sommige toepassingen beperkte.
Dat is inmiddels sterk verbeterd. PacBio's HiFi-lezingen halen tegenwoordig een nauwkeurigheid van meer dan 99,9 procent bij een leeslengte van ongeveer 15.000 tot 20.000 letters. Oxford Nanopore heeft met nieuwere poriechemie (aangeduid als R10.4) en zogeheten duplex-lezingen, waarbij beide strengen van een dna-molecuul worden gebruikt, vergelijkbare nauwkeurigheden benaderd, terwijl de leeslengte kan oplopen tot honderdduizenden en in uitzonderingsgevallen zelfs meer dan een miljoen letters.
Toch blijft er werk aan de winkel. De kosten per gesequencede letter liggen nog altijd hoger dan bij korte-lezingtechnieken, waardoor short-read sequencing de standaard blijft voor grootschalige, routinematige toepassingen zoals bevolkingsonderzoek. Ook vragen de grote hoeveelheden data die langeread-apparaten produceren om zware rekenkracht en gespecialiseerde software, wat de bredere toepassing vertraagt. In de klinische diagnostiek wordt de techniek daarom vooralsnog vooral ingezet voor specifieke, moeilijk op te lossen gevallen, zoals onopgeloste erfelijke aandoeningen, in plaats van als standaardtest voor iedereen.
Wie werken eraan?
Pacific Biosciences (PacBio), gevestigd in Californië, en het Britse Oxford Nanopore Technologies, voortgekomen uit onderzoek aan de Universiteit van Oxford, zijn de twee bedrijven die de markt voor langeread-sequencing grotendeels vormgeven. Ook marktleider Illumina, van oudsher gericht op korte lezingen, investeert in eigen long-read-technologie.
Op onderzoeksgebied speelt het Amerikaanse National Human Genome Research Institute (NHGRI), onderdeel van de National Institutes of Health, een centrale rol bij consortia als T2T en het Human Pangenome Reference Consortium, samen met academische centra als de University of California Santa Cruz, het Wellcome Sanger Institute in het Verenigd Koninkrijk en het Broad Institute in de Verenigde Staten. Ook in Nederland wordt langeread-sequencing toegepast, onder meer door onderzoeksgroepen van het Radboudumc, die de techniek gebruiken om erfelijke aandoeningen op te sporen die met korte lezingen onopgemerkt bleven.