Hi-C: hoe wetenschappers de 3D-vouwing van het genoom in kaart brengen
Stel je het DNA in een van je cellen voor als een stuk garen van ruim twee meter lang. Dat hele stuk garen zit opgepropt in de celkern, een balletje van maar een paar duizendste millimeter doorsnee. Om daar te passen, wordt het DNA op een heel precieze manier opgevouwen en verpakt. Hi-C is een laboratoriumtechniek waarmee onderzoekers kunnen meten welke delen van dat opgevouwen garen elkaar raken.
Dat klinkt misschien als een detail, maar het is belangrijk: twee stukjes DNA die ver uit elkaar liggen als je het garen zou uitrollen, kunnen door de vouwing toch vlak naast elkaar terechtkomen. Zulke toevallige buren beïnvloeden elkaar vaak, bijvoorbeeld omdat een regelstukje DNA een gen verderop aan- of uitzet. Hi-C maakt zichtbaar welke delen van het genoom dit soort ruimtelijke buren zijn, zonder dat je de cel onder een microscoop hoeft te leggen.
Wat is het precies?
Hi-C is een variant van een oudere methode die "chromosome conformation capture" heet, afgekort 3C. Het idee achter beide technieken is dat je de fysieke nabijheid van DNA-stukken in de kern kunt "vastleggen" met chemie en vervolgens uitlezen met sequencing, de techniek waarmee de volgorde van DNA-letters wordt afgelezen.
De eerste stap heet crosslinking: cellen worden behandeld met formaldehyde, een stofje dat moleculen die op dat moment dicht bij elkaar liggen aan elkaar vastplakt. Als twee stukken DNA in de kern toevallig tegen elkaar aan liggen, worden ze op dat moment als het ware met chemische nietjes aan elkaar bevestigd, via de eiwitten die er tussenin zitten.
Daarna wordt het DNA geknipt met een restrictie-enzym, een soort moleculaire schaar die DNA op vaste, herkenbare plekken doorknipt. Hierdoor ontstaan losse DNA-uiteinden, maar dankzij de crosslinking blijven de bij elkaar horende brokstukken nog wel aan elkaar hangen via de eiwitbrug.
Vervolgens worden die losse uiteinden aan elkaar geplakt in een proces dat ligatie heet, oftewel het chemisch verbinden van twee DNA-stukjes tot één nieuw, doorlopend stukje. Omdat dit gebeurt tussen stukken DNA die toevallig dicht bij elkaar lagen, ontstaan er nieuwe DNA-fragmenten die stukjes bevatten van twee plekken die in het oorspronkelijke genoom soms ver uit elkaar liggen, of zelfs van verschillende chromosomen afkomstig zijn.
Als laatste stap wordt dit hele mengsel massaal gesequenced. De computer telt vervolgens hoe vaak elke combinatie van twee DNA-plekken samen in zo'n fragment opduikt. Combinaties die vaak samen voorkomen, lagen waarschijnlijk vaak fysiek dicht bij elkaar in de cel. Het resultaat is een contactkaart: een soort grote foto met heatmap-kleuren die per paar plekken in het genoom laat zien hoe vaak ze bij elkaar in de buurt worden aangetroffen.
Op zulke contactkaarten zijn duidelijke patronen te zien. Grote gebieden van het genoom groeperen zich in zogeheten A- en B-compartimenten, die grofweg overeenkomen met actief afgelezen DNA respectievelijk stiller, dichter opgevouwen DNA. Op een fijnere schaal zijn er topologisch geassocieerde domeinen, afgekort TADs: min of meer afgebakende buurten van het genoom waarbinnen DNA-stukken relatief vaak met elkaar contact maken, en met de buurdomeinen juist minder. Met nog hogere resolutie zijn losse chromatinelussen zichtbaar, vaak gevormd doordat de eiwitten CTCF en cohesine een stuk DNA actief tot een lus samentrekken, een proces dat wel "loop extrusion" wordt genoemd.
Wat wil men ermee bereiken?
Het hoofddoel van Hi-C is begrijpen hoe de driedimensionale vouwing van het genoom samenhangt met de werking ervan. Genen worden niet alleen aan- of uitgezet door hun eigen DNA-code, maar ook door regelstukjes die soms ver weg liggen op het chromosoom en pas via de 3D-vouwing in de buurt van het gen komen. Inzicht in die vouwing helpt dus om te snappen hoe genregulatie werkt.
Een tweede doel is ziekten beter begrijpen. Als de vouwing van het genoom verstoord raakt, bijvoorbeeld doordat een grens tussen twee TADs wegvalt, kan een gen plotseling onder invloed komen van het verkeerde regelstukje. Dat kan leiden tot verkeerd aan- of uitgeschakelde genen en daarmee tot ziekte, ook als de DNA-letters van het gen zelf volledig normaal zijn.
Een heel ander, meer praktisch doel is het helpen bouwen van complete genoomkaarten van planten- en dierensoorten. Bij het sequencen van een nieuw genoom krijg je eerst allemaal losse brokstukken; Hi-C-data helpt om die brokstukken in de juiste volgorde en richting tot complete chromosomen aan elkaar te leggen, een proces dat scaffolding heet.
Voorbeelden uit de praktijk
De techniek werd voor het eerst beschreven in 2009 door Erez Lieberman-Aiden, Job Dekker, Nynke van Berkum en collega's, in een publicatie in het tijdschrift Science over de vouwing van het menselijk genoom. Dit was de eerste keer dat onderzoekers op deze manier een genoombrede contactkaart van een heel chromosoomstel konden maken.
Enkele jaren later, rond 2014, publiceerde een team rond Suhas Rao en Erez Lieberman-Aiden in het tijdschrift Cell een sterk verbeterde, veel hoger opgeloste versie van Hi-C, waarmee voor het eerst duizenden individuele chromatinelussen in het menselijk genoom in kaart werden gebracht.
Medio jaren 2010 liet een groep rond Stefan Mundlos in Berlijn met Hi-C-achtige technieken zien dat het wegvallen van een TAD-grens bij mensen kan leiden tot aangeboren afwijkingen aan de ledematen, doordat een gen plotseling onder invloed komt van de verkeerde regelstukjes. Dit was een van de eerste duidelijke voorbeelden waarbij een verstoorde 3D-genoomstructuur direct aan een ziektebeeld werd gekoppeld.
Op het gebied van genoom-scaffolding is Hi-C inmiddels een standaardonderdeel geworden van grote internationale projecten zoals het Vertebrate Genomes Project en Darwin Tree of Life, die als doel hebben om van duizenden dier- en plantensoorten complete, chromosoom-niveau genoomkaarten te maken.
Ook in kankeronderzoek wordt Hi-C ingezet, bijvoorbeeld om te ontdekken hoe structurele veranderingen in tumor-DNA, zoals stukken die zijn omgedraaid of verplaatst, de 3D-architectuur van het genoom verstoren en zo kunnen bijdragen aan het ontstaan of de groei van kanker.
Hoe ver is de techniek?
Hi-C is inmiddels een gevestigde, breed gebruikte techniek die al zo'n vijftien jaar in laboratoria over de hele wereld wordt toegepast. Het is geen experimentele nieuwigheid meer: commerciële kits en diensten voor Hi-C, ook specifiek voor genoom-scaffolding, zijn algemeen verkrijgbaar.
Toch zijn er duidelijke beperkingen. Een gewone Hi-C-meting geeft een gemiddelde van miljoenen cellen tegelijk, en zegt dus weinig over verschillen tussen individuele cellen. Om dat op te lossen zijn varianten ontwikkeld zoals single-cell Hi-C, waarmee de 3D-structuur van het genoom in aparte, individuele cellen gemeten kan worden, al is de hoeveelheid data per cel daarbij nog beperkt.
Ook is er een technische opvolger, Micro-C, die in plaats van een restrictie-enzym een ander soort enzym gebruikt (MNase) om het DNA fijner te knippen, wat een hogere resolutie oplevert. Een blijvend obstakel is de afweging tussen resolutie en kosten: om echt gedetailleerde contactkaarten te maken is veel sequencing nodig, en dat blijft prijzig. Daarnaast blijft het belangrijk te onthouden dat een contactfrequentie een statistische maat is, geen directe microscopische waarneming van fysieke nabijheid.
Wie werken eraan?
Job Dekker, verbonden aan UMass Chan Medical School in de Verenigde Staten, geldt als een van de grondleggers van zowel de oorspronkelijke 3C-techniek als Hi-C, en zijn lab blijft een van de toonaangevende groepen op dit gebied. Erez Lieberman-Aiden, werkzaam bij Baylor College of Medicine en Rice University, was eveneens nauw betrokken bij de ontwikkeling van Hi-C en de latere hoge-resolutie loop-kaarten. Bing Ren aan de University of California, San Diego is een andere prominente onderzoeker op het gebied van 3D-genoomorganisatie en genregulatie.
Op internationaal niveau speelt het Amerikaanse 4D Nucleome Project, gefinancierd door de National Institutes of Health (NIH), een grote rol: dit programma brengt tientallen onderzoeksgroepen samen om de 3D-organisatie van het genoom in ruimte en tijd systematisch in kaart te brengen, met Hi-C als een van de kerntechnieken. Ook het ENCODE-consortium, dat functionele elementen in het menselijk genoom catalogiseert, maakt gebruik van Hi-C-achtige data.
Op commercieel vlak bieden bedrijven als Dovetail Genomics (inmiddels onderdeel van Cantata Bio), Arima Genomics en Phase Genomics Hi-C-diensten en -kits aan, vooral gericht op genoom-scaffolding voor onderzoekers die het complete genoom van een nieuwe soort in kaart willen brengen.