Fluorescentie-uitlezing: hoe licht onzichtbare processen zichtbaar maakt
Fluorescentie-uitlezing is een manier om iets dat op zichzelf onzichtbaar is – een molecuul, een elektron, een chemische reactie – zichtbaar en meetbaar te maken door het licht te laten uitzenden. Dat gebeurt met stoffen die fluorescent zijn: ze absorberen licht van één kleur, bijvoorbeeld blauw, en zenden vervolgens licht van een andere kleur uit, bijvoorbeeld groen. Door heel precies te meten wanneer, waar en hoe fel dat licht verschijnt, kunnen onderzoekers afleiden wat er op microscopisch of zelfs subatomair niveau gebeurt.
Vergelijk het met een dansvoorstelling in een pikdonkere zaal waarbij de dansers glow-in-the-dark armbanden dragen. Je ziet de dansers zelf niet, maar wel de lichtpuntjes die ze produceren. Aan de beweging, kleur en helderheid van die puntjes kun je reconstrueren wat er op het podium gebeurt, zonder het zaallicht aan te hoeven doen. Fluorescentie-uitlezing werkt volgens hetzelfde principe: onderzoekers koppelen een lichtgevend label aan iets dat ze willen volgen – een stukje DNA, een eiwit, een elektron in een diamantkristal – en lezen vervolgens alleen dat licht uit om te weten wat er gebeurt.
Wat is het precies?
De basis is een fluorescerende stof, een zogeheten fluorofoor. Dit kan een klein organisch molecuul zijn, een fluorescerend eiwit dat cellen zelf kunnen aanmaken, of een kristaldefect in een materiaal. Deze stof wordt op een of andere manier gekoppeld aan het proces dat je wilt volgen: vastgeplakt aan een DNA-streng, ingebouwd in een eiwit, of het is een natuurlijk aanwezig defect in een kristalrooster.
Vervolgens wordt de fluorofoor beschenen met licht van een specifieke golflengte, meestal afkomstig van een laser of een felle LED. Dit heet excitatie: de energie van het invallende licht brengt elektronen in het molecuul tijdelijk in een hogere energietoestand.
Wanneer die elektronen terugvallen naar hun oorspronkelijke toestand, zenden ze zelf licht uit, maar met iets minder energie en dus een langere golflengte dan het invallende licht. Dit golflengteverschil heet de Stokes-verschuiving, genoemd naar de negentiende-eeuwse natuurkundige George Stokes. Dankzij dit verschil kan het uitgezonden licht met optische filters gescheiden worden van het felle excitatielicht, wat cruciaal is om een zwak signaal te kunnen waarnemen.
Een gevoelige detector – een camera met een lichtgevoelige chip, een fotomultiplicatorbuis of een enkelfotondetector – registreert vervolgens hoeveel licht er precies vrijkomt, op welk moment en soms op welke plek. Software zet die metingen om in bruikbare gegevens: een DNA-sequentie, een beeld van hersenactiviteit, of de spintoestand van een elektron.
Wat wil men ermee bereiken?
Het grote voordeel van fluorescentie-uitlezing is dat het vaak niet-invasief en zeer gevoelig is. In veel gevallen is het mogelijk om een enkel molecuul of zelfs een enkel elektron te detecteren, iets wat met de meeste andere meettechnieken niet lukt. Bovendien gebeurt de meting vaak in real time, zodat processen live gevolgd kunnen worden in plaats van achteraf gereconstrueerd.
In de biologie en geneeskunde wil men hiermee ziekteverwekkers, genetische mutaties of celactiviteit met hoge precisie opsporen, zonder het onderzochte materiaal te vernietigen. In de natuurkunde wil men de toestand van individuele quantumdeeltjes uitlezen, wat essentieel is voor experimenten in quantumcommunicatie en de bouw van quantumcomputers. Het overkoepelende doel is steeds hetzelfde: een onzichtbaar, vaak extreem klein signaal omzetten in een betrouwbaar, meetbaar lichtsignaal.
Voorbeelden uit de praktijk
DNA-sequencing bij Illumina. Sinds de introductie van de Genome Analyzer in 2006 gebruikt Illumina fluorescentie-uitlezing om DNA te ontrafelen. Bij elke stap wordt een nieuw DNA-bouwsteentje met een fluorescerend label ingebouwd; een camera registreert de kleur en weet zo welke letter van het DNA is toegevoegd. Latere systemen, zoals de NextSeq- en NovaSeq-reeks, gebruiken een slimmere "tweekanaals chemie" waarbij met slechts twee kleuren toch alle vier de DNA-letters onderscheiden kunnen worden.
Quantumexperimenten aan de TU Delft. In 2015 publiceerde de onderzoeksgroep van Ronald Hanson, verbonden aan QuTech in Delft, een spraakmakend experiment: de eerste "loophole-free" Bell-test, die aantoonde dat quantumverstrengeling echt is en niet te verklaren via verborgen variabelen. De spintoestand van elektronen in stikstof-vacature-centra (NV-centra) in diamant werd daarbij uitgelezen doordat het centrum wel of niet fluoresceert, afhankelijk van die spintoestand.
Calcium-imaging in de neurowetenschap. Onderzoekers van het Janelia Research Campus, onderdeel van het Howard Hughes Medical Institute, publiceerden in 2013 een verbeterde versie van het fluorescerende eiwit GCaMP6. Dit eiwit licht op zodra calciumionen een cel binnenstromen, wat gebeurt vlak na een zenuwimpuls. Zo kunnen onderzoekers de activiteit van duizenden hersencellen tegelijk live volgen onder de microscoop.
PCR-testen tijdens de coronapandemie. De RT-qPCR-testen die in 2020 wereldwijd werden ingezet om SARS-CoV-2 op te sporen, maken gebruik van zogeheten TaqMan-probes. Deze probes bevatten een fluorescerend label en een dempende "quencher"; zodra het virale RNA wordt vermenigvuldigd, wordt de probe geknipt en gaat het label pas dan licht uitzenden. Hoe sneller en feller het signaal, hoe meer viraal materiaal er in het monster aanwezig was.
Superresolutiemicroscopie. In 2014 ontvingen Eric Betzig, Stefan Hell en William Moerner de Nobelprijs voor de Scheikunde voor technieken als STORM en PALM. Door individuele fluorescerende moleculen willekeurig en om beurten aan en uit te laten knipperen, kunnen ze een voor een met extreme precisie gelokaliseerd worden, waardoor beelden ontstaan die veel scherper zijn dan de klassieke natuurkundige grens voor lichtmicroscopie ooit toestond.
Hoe ver is de techniek?
In de biologie en diagnostiek is fluorescentie-uitlezing volwassen technologie: DNA-sequencing en qPCR-testen zijn routinematige, in duizendvoud geautomatiseerde processen die dagelijks in laboratoria over de hele wereld draaien. De grootste uitdagingen daar liggen inmiddels bij snelheid, kosten en het combineren van meerdere metingen tegelijk, want in de praktijk kunnen meestal niet meer dan vier tot zeven verschillende fluorescerende kleuren tegelijk betrouwbaar van elkaar onderscheiden worden.
In de quantumtechnologie staat de toepassing van fluorescentie-uitlezing nog veel vroeger in de ontwikkeling. Het uitlezen van een enkel NV-centrum vereist extreem gevoelige detectoren, vaak cryogene temperaturen en zorgvuldige afscherming van omgevingslicht, en de betrouwbaarheid (uitleesfidelity) is nog niet perfect: een deel van de metingen geeft een fout resultaat. Onderzoekers werken aan snellere en nauwkeurigere uitleesmethoden, onder meer door de fluorescentie te versterken met optische holtes (cavities), maar dit blijft experimentele natuurkunde eerder dan kant-en-klare techniek.
Een blijvende technische beperking overal waar fluorescentie wordt gebruikt, is fotobleking: fluorescerende moleculen verliezen na verloop van tijd, door blootstelling aan licht, onherroepelijk hun vermogen om te fluoresceren. Ook achtergrondfluorescentie van het onderzochte materiaal zelf (autofluorescentie) kan het signaal vertroebelen. Dit soort beperkingen bepaalt in de praktijk hoe lang en hoe gevoelig een meting kan zijn.
Wie werken eraan?
In de sequencing- en diagnostiekmarkt zijn Illumina, Thermo Fisher Scientific en Roche de grootste commerciële spelers, met Bio-Rad als belangrijke leverancier van qPCR-apparatuur. Op het gebied van fluorescentiemicroscopie domineren fabrikanten als Carl Zeiss, Leica Microsystems en Nikon, die zowel de optische systemen als de bijbehorende software leveren.
In de neurowetenschap is het Janelia Research Campus (VS, onderdeel van het Howard Hughes Medical Institute) toonaangevend in de ontwikkeling van fluorescerende sensoren zoals GCaMP, in samenwerking met onder meer het Allen Institute for Brain Science in Seattle. Op quantumgebied lopen QuTech en de TU Delft in Nederland voorop met NV-centrum-onderzoek, naast groepen aan Harvard University (onder leiding van Mikhail Lukin) en diverse Max Planck-instituten in Duitsland. Landen als de Verenigde Staten, Nederland, Duitsland en Japan investeren fors in zowel de biomedische als de quantumkant van deze technologie.