Eiwitkristallisatie: hoe je een eiwit ziet door het te laten kristalliseren
Eiwitten zijn de werkpaarden van elke levende cel: ze verteren voedsel, kopiëren DNA, bestrijden indringers en sturen bijna elk chemisch proces in ons lichaam aan. Om te begrijpen hoe een eiwit precies werkt, moet je weten hoe het eruitziet op atomair niveau. Eiwitkristallisatie is de techniek waarmee wetenschappers miljarden kopieën van hetzelfde eiwit zo netjes op elkaar stapelen dat er een kristal ontstaat, net als bij suiker of zout, maar dan met een molecuul dat honderdduizenden keren groter en veel grilliger van vorm is.
Een handige analogie: stel je voor dat je een enorme berg identieke, onregelmatig gevormde puzzelstukjes hebt en die allemaal in exact dezelfde stand op elkaar moet stapelen tot een keurige, doorzichtige toren. Lukt dat, dan ontstaat een geordend rooster waar je met röntgenstraling dwars doorheen kunt schieten. Het patroon dat daaruit ontstaat, laat zich terugrekenen naar de precieze positie van elk atoom in het eiwit. Zo wordt een onzichtbaar molecuul letterlijk in kaart gebracht, en dat is de basis voor het ontwerpen van medicijnen, vaccins en industriële enzymen.
Wat is het precies?
Het proces begint met een zuiver eiwit. Onderzoekers laten bacteriën, gistcellen of kweekcellen grote hoeveelheden van het gewenste eiwit produceren en zuiveren dat vervolgens tot er vrijwel niets anders meer in het buisje zit. Onzuiverheden verstoren namelijk de vorming van een ordelijk kristalrooster.
Daarna volgt het zoeken naar de juiste omstandigheden, ook wel screening genoemd. Een eiwitoplossing wordt gemengd met een zogeheten precipitant: een zout of polymeer dat water aan de oplossing onttrekt, waardoor het eiwit als het ware wordt gedwongen om uit de oplossing te komen. Ook de zuurgraad (pH), temperatuur en concentratie worden gevarieerd. Omdat elk eiwit anders reageert, testen laboratoria vaak honderden tot duizenden combinaties tegelijk, meestal met behulp van pipetteerrobots.
De meest gebruikte methode heet dampdiffusie. Een piepklein druppeltje eiwit- en precipitantoplossing wordt in een afgesloten kamertje geplaatst naast een reservoir met een sterkere precipitantoplossing. Langzaam verdampt water uit het druppeltje naar het reservoir, waardoor de eiwitconcentratie geleidelijk stijgt. Gebeurt dit traag genoeg, dan krijgen de eiwitmoleculen de tijd om zich netjes in een rooster te ordenen in plaats van willekeurig samen te klonteren tot een waardeloze witte smurrie, ook wel amorf precipitaat genoemd.
Als na dagen tot weken een kristal is ontstaan, wordt het voorzichtig uit het druppeltje gevist en supersnel ingevroren in vloeibare stikstof, zodat de moleculen niet door de bevriezing beschadigd raken. Vervolgens wordt het kristal bestraald met röntgenstraling, meestal afkomstig van een synchrotron: een ringvormige deeltjesversneller die extreem felle röntgenstraling opwekt. Het kristal buigt die straling af in een specifiek puntenpatroon, het diffractiepatroon. Met wiskundige technieken wordt dat patroon omgerekend naar een driedimensionale kaart van de elektronenwolken in het eiwit, waarna onderzoekers daar het atomaire model op passen.
Nieuwere varianten gebruiken extreem korte, felle röntgenflitsen van een zogeheten röntgenlaser (XFEL), waarmee zelfs piepkleine kristalletjes bruikbaar zijn: het kristal wordt in een fractie van een seconde vernietigd, maar niet voordat het diffractiepatroon is vastgelegd.
Wat wil men ermee bereiken?
De belangrijkste drijfveer is fundamentele kennis: hoe grijpt een enzym een molecuul vast, hoe herkent een antilichaam een virus, hoe verandert een eiwit van vorm om een signaal door te geven? Die kennis is op zichzelf al waardevol voor de biologie.
Minstens zo belangrijk is het ontwerpen van medicijnen. Als je precies weet hoe de actieve plek van een eiwit eruitziet, de zogeheten bindingszak, kun je daar een molecuul voor ontwerpen dat er als een sleutel in een slot precies inpast en zo het eiwit blokkeert of activeert. Dit heet structuurgebaseerd geneesmiddelontwerp en is inmiddels standaardpraktijk in de farmaceutische industrie.
Kristallografie speelt ook een rol bij vaccinontwikkeling, waarbij onderzoekers de vorm van virale eiwitten, zoals het spike-eiwit van coronavirussen, in kaart brengen om te bepalen welk deel het beste als vaccinbouwsteen dient.
Daarnaast wordt kristallisatie gebruikt om medicijnen zelf te verbeteren. Sommige eiwitgeneesmiddelen, zoals bepaalde vormen van insuline, worden juist doelbewust gekristalliseerd omdat een kristalsuspensie stabieler is, geconcentreerder kan worden toegediend en het werkzame eiwit geleidelijk vrijgeeft in het lichaam in plaats van in één keer.
Ten slotte helpt de techniek bij het begrijpen van ziektes waarbij eiwitten verkeerd vouwen of samenklonteren, zoals bij Alzheimer, en bij het optimaliseren van industriële enzymen die worden gebruikt in wasmiddelen, voedingsmiddelen of biobrandstofproductie.
Voorbeelden uit de praktijk
De eerste eiwitstructuren ooit opgelost waren myoglobine en hemoglobine, de zuurstofdragende eiwitten in spieren en bloed. John Kendrew en Max Perutz kregen hiervoor in 1962 de Nobelprijs voor de Scheikunde, na jaren van kristallografisch werk dat eind jaren vijftig zijn eerste resultaten opleverde.
Dorothy Hodgkin werkte vanaf de jaren dertig aan de structuur van insuline en slaagde er pas in 1969 in om die volledig op te helderen, na decennia van verbeterde methoden en steeds betere kristallen. Haar werk aan insuline en andere biomoleculen leverde haar in 1964 de Nobelprijs voor de Scheikunde op.
Sinds 1971 worden opgeloste eiwitstructuren wereldwijd gedeeld via de Protein Data Bank (PDB), een openbare databank die inmiddels meer dan tweehonderdduizend structuren bevat en de facto standaard is geworden in de structurele biologie.
Tijdens de coronapandemie werd de kristalstructuur van het hoofdprotease van SARS-CoV-2, een enzym dat het virus nodig heeft om zichzelf te vermenigvuldigen, in recordtempo opgehelderd. Die structuur vormde de basis voor het ontwerp van nirmatrelvir, de werkzame stof in Pfizers coronamedicijn Paxlovid, dat eind 2021 goedkeuring kreeg.
Ook in de ruimtevaart wordt met eiwitkristallisatie geëxperimenteerd. Op het internationale ruimtestation ISS zijn de afgelopen jaren, onder meer via het Amerikaanse ruimtevaartprogramma en samenwerkingen met farmaceutische bedrijven zoals Merck, eiwitten en antilichamen gekristalliseerd in microzwaartekracht. Omdat zwaartekracht op aarde stromingen en bezinking veroorzaakt die kristalgroei kunnen verstoren, ontstaan er in de ruimte soms grotere en zuiverdere kristallen, wat onderzoekers helpt om stabielere formuleringen van eiwitmedicijnen te ontwikkelen.
Hoe ver is de techniek?
Röntgenkristallografie is een volwassen techniek van ruim zestig jaar oud en voor veel eiwitten inmiddels routine. Toch blijft het kristalliseren zelf het grootste knelpunt: een fors deel van alle gezuiverde eiwitten levert nooit een bruikbaar, diffracterend kristal op, ondanks uitgebreide screening. Het blijft grotendeels een kwestie van empirisch proberen, ook al hebben robots en geautomatiseerde beeldherkenning het testen van duizenden condities sterk versneld.
Bijzonder lastig zijn membraaneiwitten: eiwitten die vast in de vetlaag van een celwand zitten, samen goed voor naar schatting een kwart tot een derde van alle eiwitten in de natuur. Buiten hun vettige omgeving vallen ze vaak uit elkaar of klonteren ze samen, waardoor ze traditioneel ondervertegenwoordigd zijn in de PDB.
Twee ontwikkelingen hebben het veld het afgelopen decennium ingrijpend veranderd. Ten eerste maakten röntgenlasers (XFEL's) en zogeheten seriële femtoseconde-kristallografie het mogelijk om met duizenden minuscule kristalletjes te werken in plaats van één groot kristal, wat voor lastige eiwitten vaak makkelijker haalbaar is. Ten tweede onderging cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM), een techniek die eiwitten bevroren en zonder kristal in beeld brengt, rond 2012-2013 een grote kwaliteitssprong, wat de ontwikkelaars in 2017 de Nobelprijs voor de Scheikunde opleverde. Voor grote, flexibele eiwitcomplexen is cryo-EM inmiddels vaak de eerste keuze.
Een derde, heel andere ontwikkeling is de opkomst van AI-structuurvoorspelling. Sinds AlphaFold van DeepMind in 2020 liet zien dat een computer de vouwing van een eiwit met hoge nauwkeurigheid kan voorspellen zonder enig experiment, is voor veel toepassingen de noodzaak van kristallografie afgenomen. Toch blijft experimenteel werk onmisbaar: AI voorspelt vooral de vorm van een los eiwit, terwijl kristallografie ook laat zien hoe een medicijnmolecuul precies in een bindingszak past, hoe complexen van meerdere eiwitten samenwerken, en waar water- en metaalmoleculen zich bevinden. Beide technieken vullen elkaar tegenwoordig eerder aan dan dat de één de ander vervangt.
Wie werken eraan?
Het onderzoek draait grotendeels om grote, dure infrastructuur. Synchrotrons, de deeltjesversnellers die de felle röntgenstraling leveren, staan onder meer bij het ESRF in Grenoble, Diamond Light Source in het Verenigd Koninkrijk, DESY in Duitsland en SLAC in de Verenigde Staten. Voor de allernieuwste röntgenlasertechniek lopen faciliteiten als European XFEL in Duitsland en SACLA in Japan voorop.
Vrijwel elk groot farmaceutisch bedrijf, waaronder Pfizer, Merck, Novartis, GSK en AstraZeneca, heeft eigen afdelingen voor structurele biologie die kristallografie inzetten bij medicijnontwikkeling. Fabrikanten als Rigaku en Bruker leveren de laboratoriumapparatuur.
Op onderzoeksgebied werken universiteiten wereldwijd samen in initiatieven als het Structural Genomics Consortium, een internationaal samenwerkingsverband tussen academische instellingen en industrie dat structuren openbaar beschikbaar stelt. Ruimtevaartorganisaties als NASA, via het ISS National Laboratory, en de Europese ruimtevaartorganisatie ESA faciliteren de experimenten met kristallisatie in microzwaartekracht.
Op het gebied van computationele structuurvoorspelling is vooral Google DeepMind toonaangevend met AlphaFold, terwijl landen als de Verenigde Staten, het Verenigd Koninkrijk, Duitsland en Japan van oudsher de meeste synchrotron- en cryo-EM-capaciteit hebben. China investeert de laatste jaren fors in eigen synchrotron- en cryo-EM-faciliteiten om die achterstand in te lopen.