Eencellige RNA-sequencing: het menselijk lichaam cel voor cel in kaart brengen
Stel je een sinaasappel voor die je in een blender gooit om te ontdekken waar de vitamine C zit. Je krijgt sap dat vitamine C bevat, maar je weet niet of dat uit de schil, het vruchtvlees of de pitten komt: alles is gemengd. Traditioneel onderzoek naar activiteit in weefsel werkte lange tijd op die manier. Wetenschappers vermaalden duizenden of miljoenen cellen tegelijk en maten het gemiddelde. Eencellige RNA-sequencing (in het Engels single-cell RNA sequencing, afgekort scRNA-seq) doet het tegenovergestelde: het snijdt de sinaasappel eerst in stukjes en analyseert schil, vruchtvlees en pit apart.
Concreet meet de techniek per individuele cel welke genen 'aan' staan. Genen zijn de bouwtekeningen in het DNA van een cel; wanneer een gen actief is, maakt de cel daar een tijdelijke werkkopie van in de vorm van RNA (ribonucleïnezuur), die vervolgens als instructie dient om eiwitten te maken. Door te tellen welke RNA-moleculen in een cel aanwezig zijn, kun je afleiden wat voor type cel het is en wat die cel op dat moment aan het doen is. Doe je dat voor duizenden losse cellen uit hetzelfde stukje weefsel, dan ontstaat een gedetailleerde plattegrond van celtypen die je met de oude 'blendermethode' nooit had kunnen zien.
Wat is het precies?
Het proces begint met het loskoppelen van weefsel in losse, levende cellen, bijvoorbeeld met enzymen die het bindweefsel tussen cellen afbreken. Elke cel wordt vervolgens apart 'gevangen', historisch in de putjes van een plaat (plate-based methoden zoals Smart-seq), tegenwoordig vaker in piepkleine druppeltjes olie die met microfluïdica-chips worden gemaakt. Elke druppel bevat één cel plus een minuscuul kraaltje met een unieke DNA-'barcode'.
Binnen die druppel wordt de cel opengebroken en wordt het RNA opgevangen door het kraaltje. Een enzym (reverse transcriptase) zet het RNA om in stabieler DNA, cDNA genoemd, waarbij automatisch de barcode van die specifieke cel wordt aangeplakt. Zo weet je later, ook al worden alle druppels samengevoegd, precies uit welke cel elk stukje RNA afkomstig was. Vaak wordt ook een 'unique molecular identifier' (UMI) toegevoegd: een korte, willekeurige code per RNA-molecuul, zodat je tijdens de daaropvolgende vermenigvuldiging (PCR) kunt corrigeren voor moleculen die per ongeluk vaker gekopieerd zijn dan andere.
Al het cDNA van alle cellen samen wordt vervolgens in één keer 'gesequenced', ofwel afgelezen, met een sequencer (meestal van het bedrijf Illumina). De computer sorteert daarna miljoenen leesjes terug naar de cel waar ze vandaan kwamen aan de hand van de barcode. Met statistische methoden zoals clustering en dimensiereductie (bijvoorbeeld UMAP of t-SNE, technieken om complexe data visueel te vereenvoudigen) worden cellen met een vergelijkbaar genexpressiepatroon bij elkaar gegroepeerd. Elke cluster stelt doorgaans een celtype of celtoestand voor, die onderzoekers vervolgens een naam geven op basis van bekende merkergenen.
Wat wil men ermee bereiken?
Het achterliggende doel is simpel geformuleerd, maar enorm in omvang: een compleet 'periodiek systeem' van alle celtypen in het menselijk lichaam maken. Het menselijk lichaam bevat naar schatting tientallen biljoenen cellen, verdeeld over vermoedelijk enkele honderden tot duizenden celtypen en -subtypen, waarvan velen nog nooit precies zijn beschreven. Met zo'n atlas kunnen onderzoekers exact zien welke cellen bij een ziekte betrokken zijn, welke cellen een medicijn als doelwit gebruikt en hoe cellen zich tijdens ontwikkeling van embryo tot volwassene specialiseren.
Voor de geneeskunde is de belofte concreet: bij kanker bijvoorbeeld verschillen tumorcellen onderling sterk, en juist de zeldzame, afwijkende cellen zijn vaak verantwoordelijk voor resistentie tegen behandeling. Met bulkmetingen gaan die zeldzame cellen verloren in het gemiddelde; met eencellige sequencing worden ze zichtbaar. Ook in de immunologie, waar subtiele verschillen tussen afweercellen bepalend zijn voor ziekte of gezondheid, en in de neurowetenschap, waar de hersenen honderden verschillende neurontypen bevatten, is de techniek een gereedschap om orde te scheppen in enorme cellulaire diversiteit.
Voorbeelden uit de praktijk
Human Cell Atlas (vanaf 2016): een internationaal wetenschappelijk consortium, mede opgezet door Aviv Regev (destijds Broad Institute) en Sarah Teichmann (Wellcome Sanger Institute), met als doel een referentiekaart van alle menselijke celtypen te maken. Duizenden onderzoekers uit tientallen landen dragen data bij.
Tabula Muris (2018): een atlas van ongeveer 100.000 cellen uit twintig organen van de muis, gepubliceerd in Nature door het Chan Zuckerberg Biohub, gebruikt als referentiewerk voor muismodellen in onderzoek.
Tabula Sapiens (2022): het menselijke vervolg hierop, gepubliceerd in Science, met ruim 480.000 cellen uit 24 organen van enkele overleden orgaandonoren, samengesteld door onder meer het Chan Zuckerberg Biohub en Stanford University.
COVID-19-celatlas (2020): binnen het Human Cell Atlas-initiatief brachten onderzoekers in kaart in welke celtypen van de luchtwegen en longen het eiwit ACE2 tot expressie komt, de 'deur' waarlangs het coronavirus SARS-CoV-2 cellen binnendringt. Dit hielp verklaren waarom bepaalde celtypen in de neus en longen kwetsbaarder zijn dan andere.
Human Brain Cell Atlas (2023): het Allen Institute for Brain Science publiceerde samen met internationale partners een reeks artikelen in Science met een gedetailleerde kaart van meer dan 3.000 celtypen in de menselijke hersenen, gebaseerd op eencellige en single-nucleus RNA-sequencing.
Hoe ver is de techniek?
Als onderzoeksmethode is scRNA-seq inmiddels volwassen: het tijdschrift Nature Methods riep single-cell sequencing in 2013 al uit tot 'Methode van het Jaar', en de doorbraak van betaalbare druppel-gebaseerde platformen rond 2015-2016 (onder meer Drop-seq uit het lab van Steve McCarroll aan Harvard, en het commerciële Chromium-systeem van 10x Genomics) maakte het mogelijk om tienduizenden tot honderdduizenden cellen in één experiment te analyseren. De kosten per cel zijn sindsdien met meer dan een factor honderd gedaald.
Toch blijven er stevige beperkingen. De techniek meet doorgaans alleen RNA, niet de eiwitten die uiteindelijk het werk doen in een cel; RNA-niveau is dus een indirecte maat. Het proces van weefsel loskoppelen kan gevoelige of breekbare celtypen beschadigen of selectief verliezen, waardoor de uiteindelijke atlas niet altijd representatief is. Bevroren of moeilijk te ontsluiten weefsel (zoals hersenweefsel van overledenen) vraagt om aangepaste varianten zoals single-nucleus RNA-seq, waarbij alleen de celkern wordt geanalyseerd. Daarnaast spelen 'batch-effecten': technische verschillen tussen experimenten die verward kunnen worden met echte biologische verschillen, wat geavanceerde reken- en correctiemethoden vereist.
Een actuele ontwikkeling is de koppeling met ruimtelijke informatie: spatiale transcriptomics, door Nature Methods uitgeroepen tot Methode van het Jaar 2020, combineert genexpressiemetingen met de exacte locatie van een cel in het weefsel, iets wat bij het loskoppelen van cellen voor klassieke scRNA-seq verloren gaat. Klinische toepassing, bijvoorbeeld als routinediagnostiek bij kanker, staat nog in de kinderschoenen: de techniek is voorlopig vooral een onderzoeksinstrument, kostbaar en rekenintensief, en de stap naar gestandaardiseerde, betaalbare klinische tests moet grotendeels nog gezet worden.
Wie werken eraan?
Het veld is een mix van academische consortia en commerciële toeleveranciers. Het Human Cell Atlas-consortium verbindt onderzoeksgroepen wereldwijd, met een sterke rol voor het Broad Institute of MIT and Harvard (VS) en het Wellcome Sanger Institute (Verenigd Koninkrijk). Het Chan Zuckerberg Biohub en de bredere Chan Zuckerberg Initiative financieren en coördineren grote atlasprojecten zoals Tabula Muris en Tabula Sapiens. Het Allen Institute for Brain Science in Seattle is toonaangevend in hersencelatlassen.
Op het gebied van apparatuur en chemie domineert het Amerikaanse 10x Genomics de markt voor druppel-gebaseerde platformen, met concurrentie van onder meer Parse Biosciences, BD (Becton Dickinson) en Illumina, dat de meeste onderliggende sequencing-machines levert. Ook Aziatische instituten spelen een grote rol: het Chinese BGI (voorheen Beijing Genomics Institute) draagt via eigen sequencing-technologie en grootschalige celatlasprojecten substantieel bij, net als Japanse en Zuid-Koreaanse onderzoeksinstellingen. In Europa dragen daarnaast het European Molecular Biology Laboratory (EMBL) en diverse universitaire medische centra actief bij aan zowel methodeontwikkeling als toepassing in ziektebeelden.