Cryo-elektronentomografie: 3D-foto's van moleculen in hun natuurlijke habitat
Stel je voor dat je niet alleen een foto wilt van een cel, maar een volledige 3D-scan van alles wat er in die cel gebeurt, tot op het niveau van individuele eiwitten. Dat is in de kern wat cryo-elektronentomografie doet, vaak afgekort tot cryo-ET. Het is een beeldvormingstechniek waarmee wetenschappers cellen en de moleculaire machines daarbinnen in drie dimensies kunnen bekijken, in een toestand die zo dicht mogelijk bij levend en werkend blijft.
Een handige vergelijking is de CT-scan die artsen gebruiken om een orgaan van alle kanten te bekijken door röntgenfoto's onder verschillende hoeken te combineren tot een 3D-beeld. Cryo-ET doet iets vergelijkbaars, maar dan op een schaal die duizenden keren kleiner is: in plaats van röntgenstraling gebruikt men elektronen, en in plaats van een patiënt is het onderwerp een razendsnel bevroren stukje cel. Het resultaat is een driedimensionaal 'landschap' waarin je individuele eiwitten en eiwitcomplexen kunt zien liggen, precies zoals ze zich in de drukte van een levende cel bevinden.
Wat is het precies?
De eerste stap is vitrificatie: het monster, bijvoorbeeld een dun stukje cel, wordt in enkele milliseconden ingevroren door het in vloeibaar ethaan te dompelen. Dat gaat zo snel dat het water in de cel geen tijd krijgt om ijskristallen te vormen. In plaats daarvan ontstaat glasachtig, amorf ijs. Dat is cruciaal, want gewone ijskristallen zouden de fijne structuren in de cel verscheuren en onherkenbaar maken.
Cellen zijn meestal te dik om elektronen doorheen te sturen; de bundel wordt dan te veel verstrooid om een bruikbaar beeld te geven. Daarom wordt het bevroren monster vaak eerst dunner gemaakt met een techniek die cryo-FIB milling heet: een gerichte bundel ionen 'schaaft' als het ware laagje voor laagje weg, totdat er een plakje van zo'n honderd tot tweehonderd nanometer dik overblijft, een lamel genoemd. Dat is dun genoeg om elektronen doorheen te laten, maar nog steeds voldoende dik om echte cellulaire structuur te bevatten.
Vervolgens wordt dit dunne plakje in een elektronenmicroscoop gelegd en stapsgewijs gekanteld, meestal in stappen van een paar graden, tot een totale kantelhoek van soms wel 120 tot 140 graden. Bij elke hoek wordt een opname gemaakt: dit heet een kantelserie of tilt series. Met computeralgoritmen worden al die tweedimensionale opnames vervolgens samengevoegd tot één 3D-volume, een tomogram, op vergelijkbare wijze als bij een medische CT-scan.
Omdat elke individuele opname zwak van signaal is (te veel elektronen zouden het broze, bevroren monster beschadigen), is de ruis in een los tomogram vaak nog vrij hoog. Om toch scherpe details te krijgen van bijvoorbeeld een bepaald type eiwitcomplex, zoeken onderzoekers alle exemplaren van dat complex op binnen meerdere tomogrammen, lijnen ze computationeel op elkaar uit en middelen ze de resultaten. Deze stap heet subtomogram averaging en verbetert de resolutie aanzienlijk, soms tot het niveau waarop individuele atomaire details zichtbaar worden.
Het bijzondere aan deze hele aanpak is dat je eiwitten niet eerst hoeft te zuiveren en uit hun natuurlijke omgeving hoeft te halen, zoals bij klassieke structuurbiologie vaak gebeurt. Je bekijkt ze in situ, dus op hun eigen plek, tussen alle andere moleculen in de cel. Dit vakgebied wordt daarom ook wel in-situ structurele biologie genoemd.
Wat wil men ermee bereiken?
Eiwitten werken zelden alleen. In een cel vormen ze samen ingewikkelde moleculaire machines die DNA aflezen, voedingsstoffen transporteren, afvalstoffen afbreken of signalen doorgeven. Om te begrijpen hoe die machines echt functioneren, wil je ze het liefst zien in hun natuurlijke, drukke omgeving, niet als los eiwit in een reageerbuisje.
Dat inzicht heeft directe praktische waarde. Bij virussen zoals hiv of het coronavirus wil men precies weten hoe het virus een cel binnendringt, zich daarbinnen verpakt of juist 'uitpakt', en welke eiwitten daarbij een rol spelen: cruciale kennis voor het ontwerpen van medicijnen of vaccins die dat proces kunnen blokkeren. Bij neurodegeneratieve aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer of Parkinson, hoopt men beter te begrijpen hoe eiwitten verkeerd vouwen en samenklonteren binnen zenuwcellen. En in de meer fundamentele celbiologie helpt cryo-ET simpelweg om te ontdekken hoe een cel eigenlijk 'georganiseerd' is op moleculair niveau, iets wat lange tijd grotendeels onzichtbaar bleef.
Voorbeelden uit de praktijk
Proteasoom en ribosomen in de cel. Wolfgang Baumeister en zijn team aan het Max Planck Institute of Biochemistry in Duitsland behoren tot de grondleggers van cryo-ET. Vanaf de jaren negentig en tweeduizend ontwikkelden zij methoden om structuren als het proteasoom, het afbraaksysteem van de cel dat afgedankte eiwitten opruimt, en ribosomen, de eiwitfabrieken van de cel, rechtstreeks binnen bevroren cellen in beeld te brengen.
Het hiv-capside. De onderzoeksgroep rond John Briggs, verbonden aan het MRC Laboratory of Molecular Biology in Cambridge en later ook aan Oxford en Max Planck, gebruikte cryo-ET om te bestuderen hoe het capside van hiv-1, de eiwitmantel rond het genetisch materiaal van het virus, zich binnen een geïnfecteerde cel gedraagt en 'uitpakt'. Dit werk, gepubliceerd rond 2020-2021, gaf inzicht in een stap die relevant is voor hoe het virus zich in een cel verspreidt.
Het spike-eiwit van SARS-CoV-2. Tijdens de coronapandemie is cryo-ET gebruikt om te bekijken hoe de kenmerkende spike-eiwitten op het oppervlak van coronavirusdeeltjes eruitzien en bewegen, in werk waarbij onder meer Duitse onderzoeksgroepen, waaronder het Max Planck Institute of Biochemistry, betrokken waren, gepubliceerd rond 2020. Dat leverde een van de eerste directe 3D-blikken op de werkelijke, natuurlijke vorm van dit eiwit op het virus zelf, in plaats van op een gezuiverde, losse versie ervan.
Het nucleaire porie-complex. De kern van een cel heeft poriën die bepalen wat er in en uit mag: enorme, complexe structuren die uit honderden eiwitten bestaan. Rond 2021-2022 combineerden onderzoekers, waaronder Martin Beck, destijds verbonden aan EMBL en later aan het Max Planck Institute of Biophysics, cryo-ET met computationele en op kunstmatige intelligentie gebaseerde modellering om de bouw van dit complex verder op te helderen.
Open datadeling. Sinds ongeveer 2023 investeert de Chan Zuckerberg Initiative in een openbaar toegankelijke databank voor tomogrammen, bedoeld om ruwe cryo-ET-data beschikbaar te maken voor onderzoekers wereldwijd. Dit past in een bredere trend waarin men de enorme hoeveelheden data die deze techniek oplevert, breder deelbaar en herbruikbaar probeert te maken.
Hoe ver is de techniek?
Cryo-EM en cryo-ET maakten rond 2012-2013 een sprong voorwaarts dankzij de komst van directe elektronendetectoren, betere camera's die elektronen rechtstreeks en met minder ruis registreren. Deze ontwikkeling, soms de 'resolution revolution' genoemd, maakte het voor het eerst mogelijk om met redelijke regelmaat scherpe, betrouwbare beelden op moleculair niveau te maken.
Toch is cryo-ET geen snelle of eenvoudige techniek. Het maken van goede lamellen met cryo-FIB milling is technisch veeleisend en heeft een relatief laag slagingspercentage: veel pogingen mislukken of leveren monsters op die niet dun of stabiel genoeg zijn. Per sessie kan bovendien maar een klein stukje van een cel worden bekeken, waardoor het vinden van de juiste structuur soms zoeken naar een speld in een hooiberg is. Voor grote, onregelmatig gevormde complexen die in situ worden bekeken, haalt de resolutie in de praktijk meestal nog niet het niveau van single-particle cryo-EM, waarbij gezuiverde, identieke eiwitten in grote aantallen worden gemiddeld tot vaak echt atomaire scherpte.
Automatisering en kunstmatige intelligentie zijn actieve onderzoeksterreinen om deze knelpunten aan te pakken: software die ruis in tomogrammen vermindert, die automatisch eiwitten in de data herkent, en die het proces van lamelmaken en beeldvorming versnelt. Dat maakt de techniek geleidelijk toegankelijker, maar cryo-ET blijft voorlopig een kostbare en arbeidsintensieve methode die vooral in gespecialiseerde laboratoria wordt toegepast, geen instrument voor alledaags gebruik.
Wie werken eraan?
Het veld wordt sterk gedreven vanuit Europa. Het Max Planck Institute of Biochemistry in Duitsland geldt, mede dankzij het pionierswerk van Baumeister en zijn opvolgers, als een van de bakermatten van cryo-ET. Het MRC Laboratory of Molecular Biology in Cambridge, in het Verenigd Koninkrijk, is al decennia een zwaargewicht in structurele biologie en cryo-EM in bredere zin. EMBL in Heidelberg vervult een vergelijkbare rol als Europees knooppunt voor structurele en celbiologie.
Ook Nederland heeft een plek in dit veld: NeCEN, het Netherlands Centre for Electron Nanoscopy in Leiden, biedt onderzoekers toegang tot geavanceerde cryo-EM- en cryo-ET-apparatuur, en aan de Universiteit Leiden zijn onderzoeksgroepen actief die met deze techniek werken.
Op het gebied van apparatuur is Thermo Fisher Scientific een centrale speler: het bedrijf levert onder meer de Krios-elektronenmicroscopen en de Aquilos cryo-FIB/SEM-instrumenten die in veel laboratoria wereldwijd de standaard zijn geworden voor cryo-ET-werk. Daarnaast investeert de Chan Zuckerberg Initiative, een Amerikaanse filantropische organisatie, in open data-infrastructuur voor het vakgebied, wat wijst op een groeiende Amerikaanse betrokkenheid naast de van oudsher sterke Europese basis in Duitsland en het Verenigd Koninkrijk.