Cryo-elektronenmicroscopie: moleculen zien in bevroren toestand
Stel je voor dat je een waterdruppel wilt bestuderen op het moment dat hij een plas raakt en uiteenspat. Met het blote oog zie je alleen een wazige vlek, want de beweging gaat te snel. Bevries je die druppel echter binnen een fractie van een milliseconde, dan houdt hij zijn vorm vast en kun je hem van alle kanten bekijken en fotograferen. Cryo-elektronenmicroscopie, meestal afgekort tot cryo-EM, doet iets vergelijkbaars met de bouwstenen van het leven: eiwitten, virussen en andere moleculen die te klein zijn om met licht te zien. Onderzoekers bevriezen ze razendsnel in een dun laagje ijs en maken er vervolgens met een elektronenmicroscoop duizenden foto's van, om daaruit een driedimensionaal model op te bouwen.
Het resultaat is een soort digitale bouwtekening van moleculen op bijna atomair niveau. Die tekeningen zijn essentieel om te begrijpen hoe ziekten ontstaan, hoe medicijnen aangrijpen en hoe virussen cellen binnendringen. Tijdens de coronapandemie kon de vorm van het beruchte 'spike-eiwit' van SARS-CoV-2 al enkele weken na het vrijgeven van de genetische code met cryo-EM in kaart worden gebracht, informatie die direct werd gebruikt bij de ontwikkeling van vaccins. Cryo-EM is geen gloednieuwe uitvinding, maar de techniek maakte de afgelopen tien jaar een sprong die in de wetenschap wel de 'resolutierevolutie' wordt genoemd.
Wat is het precies?
Elektronenmicroscopie bestaat al sinds de jaren dertig van de vorige eeuw. In plaats van licht gebruikt een elektronenmicroscoop een bundel elektronen om een object af te beelden, wat een veel hogere vergroting mogelijk maakt dan een gewone lichtmicroscoop. Het probleem was lang dat elektronen alleen goed door een vacuüm reizen en dat de bundel biologisch materiaal, zoals een eiwit, meteen verwoest of vervormt.
De oplossing zit in het woordje 'cryo' (Grieks voor koud). Het monster, bijvoorbeeld een oplossing met miljoenen kopieën van hetzelfde eiwit, wordt in een fractie van een seconde ondergedompeld in vloeibaar ethaan van ongeveer -180°C. Dat gaat zo snel dat het water in het monster geen kans krijgt om ijskristallen te vormen. In plaats daarvan ontstaat 'glasachtig ijs' (vitreous ice): een amorfe, ongeordende bevroren toestand zonder de scherpe kristalstructuur van gewoon ijs. Dat is cruciaal, want ijskristallen zouden de fijne details van het molecuul verstoren.
Het bevroren monster wordt vervolgens in de elektronenmicroscoop gelegd, waar een lichte, korte elektronenbundel er duizenden keren doorheen schiet. Elke keer legt een gevoelige camera, een zogeheten directe elektronendetector, een tweedimensionale schaduwafbeelding vast van de moleculen die toevallig in verschillende richtingen in het ijs liggen. Omdat elk molecuul in een net iets andere hoek bevroren is, ontstaat een verzameling van duizenden tot miljoenen platte 'foto's' van hetzelfde object, maar dan vanuit allerlei standpunten.
De laatste stap gebeurt volledig met software. Algoritmes sorteren de foto's op gelijkenis, bepalen impliciet vanuit welke hoek elke opname genomen is en middelen ze bij elkaar tot één driedimensionaal dichtheidsmodel. Deze werkwijze heet single-particle analyse. Een verwante variant, cryo-elektronentomografie, maakt in plaats van losse moleculen juist opnamen van hele cellen of celonderdelen, door het monster onder telkens iets andere hoeken in de microscoop te kantelen.
Wat wil men ermee bereiken?
Het uiteindelijke doel is simpel te omschrijven, ook al is de uitvoering complex: begrijpen hoe de vorm van een molecuul zijn functie bepaalt. Een eiwit is in feite een lange keten aminozuren die zich opvouwt tot een specifieke driedimensionale vorm, en die vorm bepaalt precies waar het aan kan binden en wat het kan doen in een cel. Kennis van die vorm helpt bijvoorbeeld te verklaren waarom een mutatie een ziekte veroorzaakt, of waar een medicijn moet aangrijpen om een virus of tumorcel te blokkeren.
Voor de komst van cryo-EM was röntgenkristallografie de gouden standaard om zulke structuren op te helderen. Die techniek levert prachtige, zeer scherpe beelden op, maar vereist dat onderzoekers eerst een zuiver kristal van het molecuul laten groeien, wat voor grote, flexibele of membraangebonden eiwitten vaak maandenlang mislukt of onmogelijk blijkt. Cryo-EM heeft dat kristal niet nodig: een oplossing van het eiwit volstaat. Dat opent de deur naar de studie van moleculen die decennialang praktisch ontoegankelijk waren, zoals grote eiwitcomplexen, ionkanalen in celmembranen en hele virusdeeltjes.
Daarnaast hoopt men de techniek sneller, goedkoper en toegankelijker te maken, zodat structuuronderzoek niet voorbehouden blijft aan enkele goed gefinancierde laboratoria. Snellere doorlooptijden zijn ook direct relevant voor de volksgezondheid: hoe eerder de vorm van een nieuw virus of resistent bacterie-eiwit bekend is, hoe eerder gerichte medicijnen of vaccins ontwikkeld kunnen worden.
Voorbeelden uit de praktijk
TRPV1-ionkanaal (2013). Onderzoekers Yifan Cheng en David Julius van de University of California, San Francisco publiceerden de structuur van het TRPV1-eiwit, een receptor die onder meer reageert op hitte en het scherpe stofje capsaïcine uit chilipepers. Dankzij nieuwe directe elektronendetectoren kwam deze structuur voor het eerst met bijna-atomaire scherpte in beeld zonder kristallen, en het resultaat wordt algemeen gezien als het startpunt van de 'resolutierevolutie' in cryo-EM.
Nobelprijs Scheikunde 2017. Jacques Dubochet, Joachim Frank en Richard Henderson ontvingen de Nobelprijs voor de Scheikunde voor hun fundamentele bijdragen aan cryo-EM: Dubochet voor het bevriezen van water tot glasachtig ijs, Frank voor de beeldverwerkingsalgoritmes achter single-particle analyse, en Henderson voor de eerste atomaire eiwitstructuur met deze methode.
SARS-CoV-2-spike-eiwit (2020). Het laboratorium van Jason McLellan aan de University of Texas at Austin publiceerde binnen enkele weken na het vrijgeven van de genetische code van het coronavirus een gedetailleerde cryo-EM-structuur van het spike-eiwit, waarmee het virus cellen binnendringt. Deze structuur werd wereldwijd gebruikt als basis voor vaccinontwerp.
Ribosomen. Joachim Frank en collega's aan Columbia University gebruikten cryo-EM al vanaf de jaren negentig en tweeduizend om de structuur en werking van het ribosoom, de eiwitfabriek van de cel, in steeds meer detail bloot te leggen, lang voordat de resolutierevolutie de techniek voor veel meer moleculen bruikbaar maakte.
NeCEN in Leiden. Nederland heeft met het Netherlands Centre for Electron Nanoscopy (NeCEN), gevestigd bij Universiteit Leiden, sinds 2010 een nationale faciliteit waar onderzoekers uit binnen- en buitenland gebruik kunnen maken van hoogwaardige cryo-EM-apparatuur, omdat de aankoop en het onderhoud van zulke microscopen voor individuele laboratoria vaak te kostbaar zijn.
Hoe ver is de techniek?
Cryo-EM is inmiddels een volwassen, breed toegepaste techniek in de structuurbiologie, geen experimentele nieuwigheid meer. Sinds de resolutierevolutie rond 2012-2014 is het aantal gepubliceerde structuren explosief gegroeid, mede dankzij betere elektronendetectoren, krachtigere microscopen en slimmere software zoals RELION, ontwikkeld aan het Britse MRC Laboratory of Molecular Biology, en het commerciële cryoSPARC.
Voor gunstige, stabiele moleculen kan de techniek tegenwoordig een resolutie bereiken van beter dan 2 ångström, wat neerkomt op ongeveer een vijfde van een nanometer, ruim voldoende om afzonderlijke atomen te onderscheiden. Dat is vergelijkbaar met de beste röntgenkristallografie, maar dan zonder de noodzaak van kristallen.
Toch blijven er duidelijke beperkingen. Kleine moleculen, doorgaans lichter dan zo'n 50 tot 100 kilodalton, leveren nog altijd te weinig contrast op om betrouwbaar te reconstrueren. Veel eiwitten nemen bovendien tijdens het bevriezen een voorkeursoriëntatie aan, waardoor bepaalde hoeken ontbreken in de dataset en het model onvolledig of vervormd raakt, een probleem waar onderzoekers nog altijd mee worstelen. Ook de dataverwerking blijft rekenintensief: een enkele dataset kan al gauw enkele terabytes aan ruwe beelden opleveren, die vervolgens dagen tot weken rekentijd vergen.
Een aanpalende ontwikkeling is het gebruik van kunstmatige intelligentie. Modellen als AlphaFold van DeepMind, dat in 2021 doorbrak, voorspellen eiwitstructuren rekenkundig uit de aminozuurvolgorde, zonder microscoop. Cryo-EM en zulke AI-voorspellingen vullen elkaar inmiddels aan: AI-modellen helpen onderzoekers om ruwe cryo-EM-dichtheidskaarten sneller te interpreteren, terwijl cryo-EM experimentele data blijft leveren om AI-voorspellingen te toetsen en te verbeteren.
Wie werken eraan?
Op instrumentniveau wordt de markt gedomineerd door Thermo Fisher Scientific (Verenigde Staten), dat met microscopen als de Titan Krios en de compactere Glacios de facto standaardapparatuur levert aan de meeste cryo-EM-laboratoria wereldwijd. Detectortechnologie komt onder meer van Gatan, nu onderdeel van het Amerikaanse AMETEK, en het Japanse JEOL bouwt eveneens elektronenmicroscopen voor deze toepassing.
Op onderzoeksgebied geldt het MRC Laboratory of Molecular Biology in Cambridge, het instituut van Nobelprijswinnaar Richard Henderson, al decennia als een bakermat van de techniek. Ook Amerikaanse universiteiten als UCSF, Columbia University en de University of Texas at Austin spelen een vooraanstaande rol, net als diverse Max Planck-instituten in Duitsland. In Nederland vormt NeCEN in Leiden de nationale hub, met daarnaast cryo-EM-faciliteiten aan onder meer de Universiteit Utrecht.
Ten slotte investeert China de afgelopen jaren fors in cryo-EM-infrastructuur, met snel groeiende faciliteiten aan universiteiten zoals Tsinghua, terwijl landen als het Verenigd Koninkrijk, de Verenigde Staten, Duitsland en Japan hun bestaande koppositie proberen te behouden. Farmaceutische bedrijven zetten de techniek intussen steeds vaker zelf in bij medicijnontwikkeling, naast het academische onderzoek.