Cas13a: het molecuul dat RNA opspoort én kapotknipt
Cas13a is een eiwit dat afkomstig is uit het afweersysteem van bacteriën, maar dat door onderzoekers is omgebouwd tot een programmeerbaar gereedschap om specifieke stukjes RNA op te sporen en te vernietigen. RNA is de tijdelijke "werkkopie" die cellen maken van hun DNA om eiwitten te bouwen, en ook het erfelijk materiaal van veel virussen, zoals het coronavirus. Cas13a kun je vergelijken met een speurhond die een heel specifieke geur (een RNA-volgorde) moet vinden in een enorme ruimte vol geuren. Zodra de hond het juiste spoor te pakken heeft, gaat hij niet alleen op dat ene spoor af, maar begint hij ook in de buurt driftig te graven, waarbij allerlei andere dingen worden omgewoeld.
Dat "omwoelen in de buurt" is precies wat Cas13a zo bijzonder maakt. Het eiwit knipt niet alleen zijn beoogde doelwit, maar gaat daarna, eenmaal geactiveerd, ook lukraak ander RNA in de omgeving kapotknippen. Dit heet collaterale activiteit. Wat een nadeel lijkt, is in de praktijk een groot voordeel: door die extra knip-activiteit te koppelen aan een meetbaar signaal, kun je met Cas13a razendsnel en zeer gevoelig testen of een bepaald virus of gen aanwezig is in een monster. Daarnaast wordt het eiwit gebruikt om genen tijdelijk uit te schakelen, zonder het DNA zelf aan te raken.
Wat is het precies?
Cas13a maakt deel uit van de familie CRISPR-eiwitten, bekend van CRISPR-Cas9, de "gen-schaar" waarmee DNA bewerkt kan worden. Het verschil is essentieel: Cas9 knipt DNA, het permanente opslagmedium van erfelijke informatie. Cas13a knipt RNA, de vergankelijke boodschappers die cellen gebruiken om instructies uit het DNA tijdelijk uit te voeren. Omdat RNA van nature na verloop van tijd weer afbreekt, is ingrijpen op RNA-niveau in principe tijdelijker en omkeerbaarder dan ingrijpen op DNA-niveau.
Het eiwit is oorspronkelijk ontdekt in bacteriën, onder andere in de soort Leptotrichia shahii, waar het onderdeel is van een CRISPR-afweersysteem tegen virussen die bacteriën aanvallen (bacteriofagen). Onderzoekers van het Broad Institute, verbonden aan MIT en Harvard, beschreven het eiwit in 2016 voor het eerst uitgebreid in het tijdschrift Science, destijds nog onder de naam C2c2, later omgedoopt tot Cas13a.
Het systeem werkt met twee onderdelen. Ten eerste een stukje "gids-RNA" (crRNA), een kort stuk genetische code van ongeveer twintig tot dertig letters, dat exact overeenkomt met het RNA-doelwit dat je zoekt, bijvoorbeeld een stukje virusgenoom. Ten tweede het Cas13a-eiwit zelf, dat zich aan die gids-RNA bindt en er als het ware een "zoekprofiel" van maakt. Samen vormen ze een complex dat door de oplossing of cel "patrouilleert" en elk RNA-molecuul dat voorbijkomt controleert op een match.
Vindt het complex een perfecte of bijna perfecte match, dan verandert het eiwit van vorm. Daardoor worden twee actieve knipgebieden, zogeheten HEPN-domeinen, geactiveerd. Deze knippen niet alleen het gevonden doelwit, maar ook, zolang het complex geactiveerd blijft, vrijwel elk ander RNA in de buurt. Die laatste, ongerichte knipactiviteit is de collaterale activiteit waar de diagnostische toepassingen op gebaseerd zijn: voeg je kunstmatige RNA-sliertjes toe die oplichten zodra ze doorgeknipt worden, dan geeft een positieve test direct een meetbaar lichtsignaal.
Wat wil men ermee bereiken?
De belangrijkste drijfveer achter het onderzoek naar Cas13a is de behoefte aan snelle, goedkope en gevoelige diagnostiek, zonder dat daarvoor dure laboratoriumapparatuur nodig is. Klassieke virustests met PCR (polymerase-kettingreactie) zijn nauwkeurig, maar vereisen gespecialiseerde machines en getraind personeel. Een Cas13a-test kan in theorie met simpele middelen, zoals een papieren teststrip, een uitslag geven, vergelijkbaar met de laagdrempeligheid van een zwangerschapstest.
Een tweede doel is het tijdelijk en gericht uitschakelen van genen, als alternatief voor bestaande technieken zoals RNA-interferentie. Omdat Cas13a RNA knipt in plaats van DNA, is het effect in principe omkeerbaar en permanent noch erfelijk: zodra je stopt met toevoegen van het systeem, herstelt de normale aanmaak van dat eiwit zich. Dat maakt het aantrekkelijk voor onderzoek naar genfunctie en, potentieel, voor therapieën waarbij je een ziekmakend gen tijdelijk wilt afremmen.
Een derde, meer experimentele ambitie is het direct bestrijden van virussen in het lichaam, door virus-RNA te laten herkennen en vernietigen door Cas13a nog voordat het virus zich kan vermenigvuldigen. Daarnaast wordt gewerkt aan RNA-editing: het gericht corrigeren van foutjes in RNA-boodschappen, zodat een afwijkend eiwit toch correct wordt aangemaakt, zonder het onderliggende DNA te veranderen. Dit wordt gezien as een potentieel veiliger alternatief voor permanente DNA-editing, al staat dit nog in een vroeg stadium.
Voorbeelden uit de praktijk
SHERLOCK (2017): onderzoekers Omar Abudayyeh, Jonathan Gootenberg en Feng Zhang van het Broad Institute publiceerden in Science een diagnostische methode genaamd SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing), die met Cas13a onderscheid kon maken tussen het Zika-virus en het Dengue-virus in patiëntmonsters, en zelfs individuele mutaties kon opsporen.
Sherlock Biosciences en covid-19 (2020): het bedrijf Sherlock Biosciences, een spin-off van het Broad Institute, ontwikkelde op basis van dit werk een snelle test voor SARS-CoV-2. Deze test kreeg in 2020 een noodtoelating (Emergency Use Authorization) van de Amerikaanse toezichthouder FDA, een van de eerste keren dat een CRISPR-gebaseerde test die status kreeg.
REPAIR (2017): in een ander Science-artikel koppelden onderzoekers van hetzelfde Broad Institute-team een inactieve versie van Cas13 aan een enzym genaamd ADAR, om specifieke letters in RNA-boodschappen te veranderen zonder het RNA door te knippen. Dit systeem, REPAIR genoemd, werd in celkweek getest op het corrigeren van ziekteveroorzakende mutaties.
CasRx / Cas13d (2018): de onderzoeksgroep van Patrick Hsu, destijds verbonden aan het Salk Institute, beschreef in het tijdschrift Cell een kleinere Cas13-variant, Cas13d, die onder de naam CasRx efficiënter bleek in het uitschakelen van RNA in cellen en makkelijker te verpakken is in gentherapie-vectoren vanwege zijn compacte formaat.
PAC-MAN (vanaf 2020): onderzoekers van Stanford University, onder leiding van Stanley Qi, onderzochten of Cas13 gebruikt kan worden om virus-RNA van SARS-CoV-2 en griepvirussen direct in cellen te herkennen en te vernietigen, als een soort programmeerbaar antiviraal middel. Dit werk bevond zich bij publicatie nog in een vroeg, celkweek-stadium.
Hoe ver is de techniek?
De ontwikkelstatus verschilt sterk per toepassing. Diagnostiek staat het verst: er bestaan al gevalideerde, commercieel beschikbare Cas13a-gebaseerde testen, en de SARS-CoV-2-test van Sherlock Biosciences heeft daadwerkelijk een noodtoelating gekregen. Toch zijn deze testen nog geen vervanging van PCR in de meeste laboratoria; ze worden vooral ingezet in specifieke situaties waar snelheid belangrijker is dan de allerhoogste nauwkeurigheid, en de ambitie van een goedkope thuistest op papier is nog niet op grote schaal gerealiseerd.
Het gebruik van Cas13a om genen tijdelijk uit te schakelen is inmiddels een gangbaar hulpmiddel in onderzoekslaboratoria wereldwijd, maar dit is onderzoeksgereedschap, geen behandeling bij patiënten. RNA-editing met systemen zoals REPAIR bevindt zich nog in een pril, preklinisch stadium: er zijn geen goedgekeurde therapieën op basis van Cas13-RNA-editing, en het duurt doorgaans jaren om van een celkweekexperiment naar een klinische studie te gaan. Antivirale toepassingen zoals PAC-MAN zijn eveneens experimenteel en nog niet bij mensen getest.
De belangrijkste technische obstakels zijn vergelijkbaar met die van andere CRISPR-toepassingen: hoe krijg je het systeem veilig en gericht in de juiste cellen van het lichaam (het zogeheten deliveryprobleem), hoe voorkom je dat het eigen immuunsysteem de bacteriële eiwitten aanvalt, en hoe beperk je ongewenste nevenschade door de collaterale knipactiviteit wanneer het systeem in levende cellen wordt gebruikt in plaats van in een reageerbuis. Voor diagnostische toepassingen is dat laatste punt juist een voordeel, maar voor therapeutisch gebruik is het een risico dat eerst goed in kaart gebracht moet worden.
Wie werken eraan?
Het fundamentele onderzoek naar Cas13a is grotendeels voortgekomen uit het laboratorium van Feng Zhang aan het Broad Institute of MIT and Harvard, een van de grote centra voor CRISPR-onderzoek wereldwijd. Jonathan Gootenberg en Omar Abudayyeh, beiden betrokken bij de oorspronkelijke SHERLOCK-publicaties, richtten later het bedrijf Sherlock Biosciences op om de diagnostische toepassingen te commercialiseren.
Daarnaast is Mammoth Biosciences, mede opgericht door Nobelprijswinnaar Jennifer Doudna, actief op het gebied van CRISPR-diagnostiek, met onderzoek dat zowel verwante Cas-eiwitten als Cas13-achtige systemen omvat. De groep van Patrick Hsu, eerst bij het Salk Institute en later bij het Arc Institute, heeft met Cas13d/CasRx een belangrijke technische verbetering geleverd. Stanley Qi en collega's aan Stanford University onderzoeken antivirale toepassingen.
Geografisch is dit onderzoeksveld sterk geconcentreerd in de Verenigde Staten, met name rond Boston/Cambridge (Broad Institute, MIT, Harvard) en Californië (Stanford, Berkeley, het voormalige Salk Institute). Ook in Europa en Azië lopen onderzoeksprojecten die CRISPR-diagnostiek verder ontwikkelen en lokaal valideren, vaak in samenwerking met of voortbouwend op het Amerikaanse basisonderzoek.