BUSCO-analyse: hoe controleer je of een genoom compleet is?
Stel je voor dat iemand je een dik telefoonboek geeft en beweert dat het compleet is. In plaats van elke pagina na te lopen, controleer je een handvol namen waarvan je weet dat ze in vrijwel elk telefoonboek moeten staan: de brandweer, het gemeentehuis, een paar grote ziekenhuizen. Staan die erin en kloppen de nummers, dan is de kans groot dat het boek grondig is samengesteld. Ontbreken ze, dan is er iets misgegaan. BUSCO-analyse werkt volgens hetzelfde principe, maar dan voor DNA.
BUSCO staat voor Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs en is een computerprogramma waarmee onderzoekers controleren of een genoomassemblage — het digitale bouwwerk dat ontstaat nadat losse DNA-stukjes van een sequencer weer aan elkaar zijn gepuzzeld — wel echt compleet en betrouwbaar is. In plaats van het hele genoom met de hand te controleren, zoekt BUSCO naar een beperkte set genen waarvan bekend is dat vrijwel elke soort in een bepaalde groep ze precies één keer bezit. Ontbreken die genen, of zijn ze stuk, dan is dat een signaal dat de assemblage nog gaten of fouten bevat.
Wat is het precies?
Om BUSCO te begrijpen, moet je eerst weten wat een ortholoog is. Orthologe genen zijn genen in verschillende soorten die afstammen van hetzelfde voorouderlijke gen en meestal nog steeds dezelfde functie vervullen — te vergelijken met hetzelfde recept dat in verschillende families is doorgegeven en licht is aangepast, maar in de kern hetzelfde gerecht oplevert. Sommige van die genen zijn zo fundamenteel voor het leven — bijvoorbeeld voor celdeling of eiwitproductie — dat bijna elke soort binnen een grotere groep (zoogdieren, insecten, planten, schimmels) er precies één kopie van heeft. Dat noemen we near-universal single-copy orthologs: bijna-universele genen die maar één keer voorkomen.
BUSCO gebruikt vooraf samengestelde lijsten van dit soort genen, afkomstig uit de database OrthoDB, die voor tientallen grote levensgroepen apart is opgebouwd. Er bestaat bijvoorbeeld een aparte genenlijst voor zoogdieren, een voor insecten en een voor gistachtigen, telkens gebaseerd op honderden reeds bekende genomen binnen die groep. Wil je de assemblage van een nieuw gesequenced zoogdier controleren, dan kies je de zoogdierenlijst; die bevat doorgaans enkele duizenden van dit soort genen.
Vervolgens doorzoekt BUSCO het nieuwe genoom met behulp van gespecialiseerde genvoorspellingsprogramma's — historisch onder meer tBLASTn en Augustus, in recentere versies aangevuld met snellere tools als Metaeuk en Miniprot — gecombineerd met het zoekprogramma HMMER, dat statistische profielen van elk gen gebruikt om ook onvolledige of licht afwijkende varianten te herkennen. Elk gen uit de lijst krijgt daarna een van vier labels: Complete (volledig en intact teruggevonden, opgesplitst in Single-copy als het één keer voorkomt en Duplicated als het per ongeluk of biologisch verdubbeld is), Fragmented (slechts een deel van het gen teruggevonden) of Missing (helemaal niet gevonden). De uitkomst is een simpel percentageoverzicht, bijvoorbeeld "C:98,4% [S:97,1%, D:1,3%], F:0,4%, M:1,2%", dat in één oogopslag laat zien hoe volledig een genoom is.
Wat wil men ermee bereiken?
Het sequencen van een genoom levert in de praktijk nooit meteen een perfecte, aaneengesloten DNA-streng op. Sequencers lezen het DNA in korte of middellange stukjes, die daarna door software weer worden samengevoegd tot een assemblage. Dat proces kan mislukken op plekken met herhalende DNA-patronen, lage sequencingdiepte of technische ruis, waardoor er gaten, verkeerd geplakte stukken of ontbrekende delen ontstaan. Voordat een genoom bruikbaar is voor verder onderzoek — vergelijkingen tussen soorten, het zoeken naar ziekteverwekkende mutaties, natuurbeschermingswerk — moet je weten hoe betrouwbaar het is.
BUSCO geeft daarvoor een snelle, vergelijkbare kwaliteitsmaat die niet afhankelijk is van het bestaan van een referentiegenoom van dezelfde soort. Dat is essentieel bij het in kaart brengen van nieuwe of nooit eerder gesequencede soorten, wat precies de ambitie is van grootschalige biodiversiteitsprojecten. Onderzoekers gebruiken BUSCO-scores ook om verschillende assemblagemethoden met elkaar te vergelijken, om te beslissen of een genoom "publicatiewaardig" is, en om annotaties (de voorspelling van waar genen precies liggen) te controleren. Het doel is dus niet perfectie garanderen, maar een eerlijke, herhaalbare maatstaf bieden voor hoe compleet en accuraat een stuk digitaal DNA is.
Voorbeelden uit de praktijk
Het Earth BioGenome Project, een internationaal initiatief dat sinds de start in 2018 de ambitie heeft om de genomen van alle bekende eukaryote soorten op aarde (naar schatting anderhalf tot twee miljoen) in kaart te brengen, hanteert BUSCO-scores als onderdeel van zijn kwaliteitsstandaarden voor nieuwe assemblages.
Het Vertebrate Genomes Project (VGP), dat sinds 2017 werkt aan hoogwaardige referentiegenomen van gewervelde diersoorten en in 2021 een reeks resultaten publiceerde in Nature, gebruikt BUSCO structureel in zijn assemblagepijplijn om de kwaliteit van elk nieuw genoom te rapporteren.
Het Britse Darwin Tree of Life Project, geleid vanuit het Wellcome Sanger Institute en gestart in 2019 met als doel het genoom van alle ongeveer 70.000 soorten in het Verenigd Koninkrijk te sequencen, publiceert bij vrijwel elke nieuwe soortassemblage een BUSCO-score als kwaliteitslabel.
Ook het DNA Zoo-consortium, dat genomen van dierentuindieren en bedreigde soorten assembleert, en talloze individuele onderzoeksartikelen over pas gesequencede planten-, schimmel- en dierensoorten rapporteren tegenwoordig standaard een BUSCO-percentage naast de klassieke assemblagestatistieken.
Hoe ver is de techniek?
BUSCO zelf is inmiddels een volwassen, breed gebruikt hulpmiddel: het werd voor het eerst beschreven in 2015 in het tijdschrift Bioinformatics door een team rond Evgeny Zdobnov, en is sindsdien meerdere keren herzien. De belangrijkste ontwikkeling door de jaren heen is dat de onderliggende genvoorspellers sneller en nauwkeuriger zijn geworden, dat de OrthoDB-genenlijsten zijn uitgebreid en verfijnd naarmate er meer referentiegenomen beschikbaar kwamen, en dat het gebruiksgemak (bijvoorbeeld geautomatiseerde herkenning van de juiste genenlijst) is toegenomen. Over het precieze allernieuwste versienummer en de laatste wijzigingen op het moment van lezen kan ik geen actuele garantie geven; check bij twijfel de officiële documentatie.
De belangrijkste beperking van BUSCO is dat het geen absolute waarheid meet, maar een steekproef: een hoge score zegt dat de gecontroleerde "kernsteekproef" van genen intact is, maar garandeert niet dat de rest van het genoom foutloos is. Bij soorten die ver afstaan van de soorten waarop de gebruikte genenlijst is gebaseerd, of bij groepen met weinig goed bestudeerde verwanten (denk aan sommige ongewervelden, schimmels of microben), kan de score minder betrouwbaar zijn. Ook zeer complexe genomen, bijvoorbeeld met veel herhalend DNA of recente genoomverdubbelingen (vaak bij planten), blijven voor elke assemblagemethode een uitdaging, ongeacht wat BUSCO rapporteert. Het instrument wordt daarom altijd gebruikt náást, niet in plaats van, andere kwaliteitsmaten zoals aaneengeslotenheid (bijvoorbeeld de zogeheten N50-waarde) en handmatige inspectie.
Wie werken eraan?
BUSCO is ontwikkeld en wordt onderhouden door de onderzoeksgroep van bio-informaticus Evgeny Zdobnov, verbonden aan de Universiteit van Genève en het Swiss Institute of Bioinformatics (SIB) in Zwitserland. Dezelfde groep beheert ook de onderliggende OrthoDB-database, waarmee BUSCO nauw verweven is.
Daarnaast wordt de tool wereldwijd toegepast en verder gevalideerd door de vele consortia die grootschalige genoomprojecten uitvoeren, waaronder onderzoeksinstituten als het Wellcome Sanger Institute (Verenigd Koninkrijk), diverse universiteiten die deelnemen aan het Earth BioGenome Project en het Vertebrate Genomes Project, en tal van nationale genoominitiatieven die BUSCO als standaardonderdeel van hun kwaliteitscontrole hebben opgenomen. Het is geen commercieel product maar vrij beschikbare, open-source wetenschappelijke software.